1、我国狂犬病近年来发病人数逐年递增，据统计我国2003年狂犬病病死人数达2037人，是10年来最高峰，截至今年12月，全国狂犬病死亡人数已超过3000人。甲醛、乙醚、升汞、过氧化氢、高锰酸钾和季胺类化合物（如本扎溴铵）等化学药品对狂犬病毒都有杀伤作用。1%甲醛或3%来苏尔15分钟可使病毒灭活。20%乙醚、10%氯仿、75%酒精、5%碘酊和0.1%胰蛋白酶等也可使病毒灭活。NON NERVOUS TISSUES(MUSCLE CELLS)PERIPHERAL NERVOUS SYSTEMCENTRAL NERVOUS SYSTEMDEATHAXOPLASMIC FLOW RECEPT ORS?NO
2、N NERV OUSTISSUES(SALIVA RYGLANDS)AXOPLASMIC FLOW 一旦狂犬病毒进入中枢神经，侵犯脑和脊髓的神经细胞，并大量增生，则引起神经细胞功能紊乱和退行性病变，机体开始出现症状，一旦发病，目前尚无法医治，病死率为100。狂犬病毒在脑神经细胞中大量增生后，通过传出神经离心性地向外扩散到周围神经及其所支配的组织中，从而引起广泛的非神经组织的感染，常累积于唾液腺，病毒大量增生而由唾液腺排除体外，一般出现典型的狂犬病症状后一周内死亡。365 (天)0 464 846 226 19 （）0 29.8 54.4 14.6 1.2WHOWHO推荐的暴露后治疗指南推荐的暴
3、露后治疗指南狂犬病发病与抗体消长趋势狂犬病发病与抗体消长趋势疫苗注射疫苗注射0天天7天天14天天180天天360天天自主抗体低水平期自主抗体低水平期3天天28天天体内自主抗体水平体内自主抗体水平发病率发病率4343天天103103天天体内被动免疫抗体水平体内被动免疫抗体水平被动免疫被动免疫 使用年代使用年代 制备来源制备来源 效力效力 注射次数注射次数第一代狂犬病疫苗第一代狂犬病疫苗 羊脑组织疫苗羊脑组织疫苗 0.8 IU/ml 21（20世纪世纪6070年代）年代）第二代狂犬病疫苗第二代狂犬病疫苗 地鼠肾细胞疫苗地鼠肾细胞疫苗 原倍疫苗原倍疫苗 1.3 IU/ml5（20世纪世纪8090年代
4、）年代）浓缩疫苗浓缩疫苗 2.5 IU/ml 5 第三代狂犬病疫苗第三代狂犬病疫苗 Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗 2.5 IU/ml 5（21世纪）世纪）0.19911CBG9908CBG9916CBG9719cCAMB02006CBGGX9912CBGGX01017VNMGX01016VNM8743THA8734THA8758cTHA8760cTHA8738THA8664cTHAI020059910LAO02002LAO02001LAOGX9914CBGGX9915BIRGX9909BIR9913BIRGX8677cMAL02042CHIGX02041CHIGX02045CHIGX020
5、43CHIGX02044CHI02040CHIGX9811CHI02035CHI02036CHI02037CHI03003INDOFL9707CHIGX02050CHIFL94270PHI94280PHIGX94273PHIGX03007PHI03006PHI02047CHIGX02049CHIGX02046CHI9709cCHI9702INDI94257cSRI9903NEPGX9902NEP9901NEP94260cNEP020529706CHIGX8690CHIGXRCHLCVSPVaGCTN亚洲街毒分离株亚洲街毒分离株N基因序列进化图基因序列进化图中国街毒1组中国街毒3组中国街毒2组中
6、国街毒4组街毒街毒3组组街毒街毒2 2组组街毒街毒4 4组组街毒街毒1 1组组武生旺宁的制备流程 武生旺宁精制苗的纯度纯化后去除了9598的杂蛋白残余牛血清含量50ng/ml05101520253035副反应发生率（%）全身反应局部反应武生旺宁武生旺宁国外产品国外产品国内产品国内产品狂犬病疫苗临床反应观察结果狂犬病疫苗临床反应观察结果20020201 3.77 20030101 3.2120020302 2.61 20030102 3.6320020503 2.67 20030103 2.9420020604 2.55 20030204 2.8220020905 2.92 20030205 3
7、.1020021006 3.36 20030206 2.9020021007 5.00 20030307 3.2320021108 2.99 20030308 2.8920021109 3.21 20030309 3.1520021210 2.89 20030410 2.9520021211 2.72 武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗中国国家标准品的制备中国国家标准品的制备武汉生物制品研究所起草武汉生物制品研究所起草中国药典中国药典狂犬病疫苗规程狂犬病疫苗规程引起过敏反应引起过敏反应的血清成分的血清成分具有中和活性具有中和活性的血清成分的血清成分 狂犬病毒通常在
8、感染的活体神经细胞中或体外感染狂犬病毒的培养细胞的胞浆中形成尼氏小体和病毒颗粒，而尼氏小体和病毒可以通过组织切片或以荧光素标记的特异性抗体进行免疫组化染色或其他方法进行检测，这些方法用于实验室诊断既精确、又快速和经济。尼氏小体大多出现在海马回、大脑皮质的锥体细胞和浦肯也氏细胞中，较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和感觉神经节等神经组织中，因此在进行神经组织为标本的实验室诊断中，其标本的选择就显得尤为重要。通常采用非常简单的手术即可暴露海马回，打开颅骨暴露脑组织后沿大脑半球背面半球沟外测2cm处往下通过灰质和白质直到侧脑室纵切35cm，掀开上部脑半球，即可露出光滑的形似蚕豆状的海马回，取出海马回、
9、部分小脑和脑干，分别在载玻片上印压制成脑印片，室温干燥后浸入丙酮30分钟，取出晾干即可用于荧光抗体实验。狂犬病毒感染的细胞内有由狂犬病毒核衣壳聚集形成的包涵体。以提纯的狂犬病毒核衣壳免疫实验动物制备的多克隆抗体，或抗核衣壳单克隆抗体与异硫氰酸荧光素偶联后，用直接免疫荧光法可特异地与这些包涵体结合，该方法是狂犬病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法。狂犬病毒抗原荧光标记抗狂犬病毒抗体免疫荧光实验检测狂犬病毒抗原 脑或神经组织的印片、涂片或冰冻切片经过标记有异硫氰酸荧光素的狂犬病毒抗血清或球蛋白处理后，在紫外线激发下，通过荧光显微镜即可检测，狂犬病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒，呈不同的
10、形状和大小，较大的圆形或椭圆形发强烈荧光者为内基氏小体（Negri bodies)，而象沙粒或灰尘的较细小的荧光粒子及丝状荧光物为神经元或树突中含有的狂犬病毒颗粒，荧光颗粒大小范围为0.24-27m。由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处，因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。脑样品印片必须用丙酮固定30分钟，因为丙酮可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂犬病毒结合。待测脑样品必须在含50%甘油的生理盐水中0C以下保存，印片染色前需用生理盐水洗涤数次，印片及丙酮固定过程需要在P3实验室中进行。武汉生物制品研究所徐葛林等采用多种抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体混合物标记荧光素，经法国巴斯德
11、研究所多次实验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等12种动物来源的样品，包括目前已知的狂犬病毒7个基因型在内的共计360多份样品，与BIO-RAD同类产品相比，证实我国制备的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度高、使用前不需用正常鼠脑吸附的特点，得到国外同行的认可。荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。目前有关狂犬病毒FAT检测试剂已完全国产化，1999年用该方法检测了我国广西狗肉市场上出售的食用狗的脑组织，结果发现在154份外观健康的犬中，有5份为狂犬病毒抗原阳性，通过乳鼠颅内接种已分离到这5株狂犬病街毒株。RREID可通过检测脑组织中的狂犬病毒
12、核衣壳来诊断狂犬病。将标本于缓冲液或组织培养液中研磨成30匀浆，1500g离心5分钟取上清，置于微量反应板中孵育（该板已用抗狂犬病毒核衣壳抗体包被），然后再用过氧化物酶标记的抗狂犬病毒核衣壳抗体来检测被捕获的抗原，加显色底物进行酶促颜色反应。对于一个给定的标本，通过用肉眼观察颜色反应或用酶标仪测光吸收值，再与阴、阳对照比较，即可得出有无狂犬病毒抗原的结论。该方法所能检测到的基因1型狂犬病毒最小核衣壳抗原量为0.8-1.0 ng/ml。该方法由Perrin.P 于1986年建立，后经欧美6个实验室试验，共检测了3000多个样品，结果表明与FAT有很好的相关性（96%），由于不需要特别的仪器和技术
13、，该方法尤其适用于发达国家，但其灵敏度略低于FAT。武汉生物制品研究所用抗狂犬病毒核蛋白的单抗建立了用于检测狂犬病毒抗原的双抗体夹心ELISA法，目前经与小鼠颅内接种及FAT法相比较，检测了近1000份动物脑组织，结果完全一致，该试剂盒对基因1型的狂犬病毒检出灵敏度达到0.8 ng/ml，对狂犬病毒7个基因型均能检出。抗狂犬病毒单抗狂犬病毒样品酶标抗狂犬病毒抗体技术特点及要求本方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、重复性好、不需要昂贵仪器等特点，最适合于作现场流行病学调查。本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C备用。肉眼观察阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显色样品，无论深浅均
14、认为是阳性。福尔马林固定的样品不适宜作RREID。使用酶标记抗体前的加样、孵育及洗涤过程需要在P3实验室中进行。狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗原的检查。可采用小白鼠接种分离，任何品种的实验用小白鼠均可使用，一般选择体重10-20克的健康小白鼠，雌雄不限。如用1-3日龄的乳鼠，可提高分离病毒的阳性率。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离，一般前者病毒检出率要高于后者，但从流行病学观点考虑，检查唾液腺中的病毒更显重要。脑组织需要预先用含1050灭活牛血清的生理盐水或PBS或脱脂奶研磨成10悬液，150200g离心5分钟去除粗颗粒；唾液腺需切碎后再研磨，1
15、2层无菌纱布过滤后，颅内接种小鼠，0.03ml/只。狂犬病毒后潜伏期至少5天，一般观察21天，小鼠狂犬病症状一般为竖毛、战栗（用镊子夹尾悬空时）、后肢失调（置于桌上使其运动时）、麻痹、衰竭（濒死前）。MIT法的特点该方法灵敏度高，仅适于分离活的狂犬病街毒，不适于因腐烂或其他原因导致病毒灭活的样品。仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒，需配合免疫荧光法作特异性鉴定。耗时较长，不适于作快速诊断用。需要在P3实验室中操作，并需要有经验的技术员。上世纪70年代中期以来，各实验室相继用婴地鼠肾细胞、BHK21、鸡胚细胞、成神经瘤细胞分离街毒狂犬病毒。与小鼠颅内接种法相比所需时间大大缩短，BHK21细胞培
16、养法的敏感性与小鼠颅内接种法相似，而小鼠成神经瘤N2a细胞分离街毒比BHK21细胞更为敏感。30%脑悬液样品，5000rmp，5minN2a细胞，继续培养24h后固定，加荧光标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体细胞无荧光，表明样品中不含狂犬病毒细胞有荧光，表明样品中含有狂犬病毒与MIT相比，RTCIT法操作简便、成本低、耗时短，灵敏度与MIT相同，适于快速诊断。由于狂犬病毒对感染细胞不形成空斑，因此通过普通显微镜无法观察到细胞病变，借助于荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白即可检查出感染的细胞。动物脑组织用含抗生素及10灭活牛血清的EMEM培养液研磨成0（w/v）悬液后2000g离心30分钟，取上清0.1ml加
17、入0.1ml的N2a细胞悬液（5105细胞/ml）于96孔微量细胞培养板孔中，37C 5 CO2孵箱中培养24小时，甩出培养液，板孔用80冷丙酮室温固定30分钟，甩干，晾干后加入荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白的抗体，37C孵育45分钟,PBS洗涤即可通过荧光显微镜观察。胞浆中有黄绿色荧光颗粒的为狂犬病毒阳性，无荧光颗粒者为狂犬病毒阴性。诊断技术 免疫荧光 快速酶 小鼠颅内 细胞培养 胶体金 实验 免疫诊断 接种 分离技术 免疫层析法所需时间 2-3h 3-4h 5-10d 20-24h 5-10min特异性 99.99%99.96%ND 99.99%ND敏感性 99.99%98.06%ND 98
18、.21%ND 滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露后治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。WHO狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5国际单位（IU）/ml的抗体水平才具有足够的保护性，如果滴度低于0.5IU/ml，必须给予加强剂量，直到抗体达到要求的水平。也可在血库中进行抗体滴定以筛选来自免疫供体的血浆样品，用以制备治疗用人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）。特异狂犬病抗体的检测也有利于不明原因病毒性脑炎病人的病原学诊断。1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。RFFIT为现代试验室的首选方法，其敏感
19、度至少与MNT一致。三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒（设已知国际单位的标准血清对照）CVS鼠脑悬液（稀释成30-300LD50）等量混合 37保温1小时后 37中和1小时 复滴定LD50 颅内接种10-12克小白鼠 观察并记录小鼠发病及死亡情况 根据试验结果计算中和指数及中和抗体含量特点：可定量检测狂犬病毒中和抗体效价；需专门技术培训，操作较繁琐；实验周期需14天，耗时长，不利于快速诊断；需较多试验小鼠，成本高；动物间的个体差会影响试验结果，我国药典收录的狂犬病中和抗体滴定法即用此法。原理：将预先滴定致细胞80感染的攻击毒株CVS与3倍系列稀释的待滴定血清37C孵育1小时，试验
20、中设包括已知中和抗体国际单位含量的参照血清，再将血清/病毒混和液加入BSR细胞悬液。37C 5CO2孵育24小时后，细胞单层用80冷丙酮固定，加荧光标记的抗核衣壳抗体进行染色，检测未被中和的病毒的存在（荧光灶），通过Reed-Muench法计算待滴定血清中狂犬病毒中和抗体单位。三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒（设已知国际单位的标准血清对照）CVS病毒悬液（致80细胞感染的病毒量）等量混合 37保温1小时后 37中和1小时 复滴定FFU 接种BSR细胞 CO2孵箱37培养24小时 固定并用荧光抗体染色，荧光镜观察，记录每孔荧光灶数量，计算血清抗体效价特点：可定量检测狂犬病毒中和抗
21、体效价；耗时较短，可用于精确定量的快速诊断；重复性好；需专门技术培训，操作较繁琐；需荧光显微镜。该方法为WHO推荐的狂犬病中和抗体首选滴定法，武汉生物制品研究所已从法国成功引进此法，所用荧光抗体已完全达到国产化。酶免疫吸附法是七十年代建立的方法，目前世界上用于检测狂犬病毒抗体初步筛选的酶免疫法基本上是采用间接ELISA法，其吸附抗原有全病毒颗粒、纯化的狂犬病毒糖蛋白以及纯化的狂犬病毒核衣壳蛋白（RNP），并以过氧化物酶标记的抗抗体作为标记抗体，即可检测人及不同动物血清中的抗狂犬病毒抗体。抗狂犬病毒单抗包被 狂犬病毒抗原待检人血清中的抗狂犬病毒抗体酶标抗人IgG抗体显色底物 表2 EIA与MNA
22、检测狂犬病毒抗体结果比较免疫用疫苗 例数 MNA EIA EIA 阳性数 阳性数 阳检率 维尔博苗 74 74 74 100%aG浓缩苗 67 67 62 92.5%CTN精制苗 34 /31 91.2%各种检测狂犬病毒抗体的ELISA法的抗原抗体比较 酶免疫吸附法 吸附抗原 所检测的抗体 间接ELISA 纯化狂犬病毒糖蛋白 抗狂犬病毒糖蛋白抗体（中和抗体）间接ELISA 纯化全病毒颗粒 抗狂犬病毒抗体（含中和抗体）间接ELISA 粗制狂犬病毒 抗吸附抗原的抗体（含中和抗体）夹心间接ELISA 狂犬病毒抗原 抗狂犬病毒抗原抗体（含中和抗体）特点：ELISA只需简单的实验室设备，尤其适合检测大量的血清样品，且在很短的时间内即可出结果。ELISA法与MNT有较好的相关性，在小鼠饲养及组织培养不具备的实验室里，ELISA可视为MNT的替代方法。严格地讲，ELISA实验并没有测定真正的中和抗体，所测抗体为几乎所有的与包被板上抗原结合的IgG抗体，包括一些非特异性抗体，所以其结果不用国际单位（IU/ml）表示，而是用等价单位（EU/ml）表示。各血清学试验获得结果所需时间 方法 MNTRFFITELISAIFA时间 21天26小时4小时2小时定性或 定量定量 定量 定性定量
