1、血液分子生物学基因治疗2 2、间接疗法：、间接疗法：以正常的基因替代致病基因以正常的基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因导入外源正常基因，代替有缺陷的基因,使细使细胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）的目的。的目的。而对靶细胞而言，而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的没有去除或修复有缺陷的基因基因。表 达目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA造血干细胞地中海贫血、严重体细胞基因治疗临床实验已经开始，生殖细胞基因治疗正在完善。是我国基因治疗成功的例子。*在gag,pol,env 序列去除的区域，插入目的基因血液分子生物学
2、基因治疗病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；5 LTR F neo SV PSO LTR 3（3）脂质体法（liposome）（白介2）（肿瘤坏死因子）自杀基因 +病毒载体U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。以正常的基因替代致病基因。*将env序列插入经改造的质粒重组基因 DNA评价表达情况10天（1）受精卵受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。以正常的基因替代致病基因。（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效卵细胞 去核 细胞1974年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导一次可获取少者35个，多者十几个。三、基因治疗的现状与前景IL2 Gene TNFG
3、ene3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞TdR病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达；目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。定 位自杀基因 +病毒载体1、生殖细胞基因治疗P p因此病毒载体是良好的基因转运载体；该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留TdR这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。一次可获取少者35个，多者十几个。重组细胞 回植 Dolly胞
4、内装配为成熟的病毒体；药物前体 无毒*gag,pol,env 序列去除，保留LTR 和，使血液分子生物学基因治疗2、体细胞基因治疗一次可获取少者35个，多者十几个。导入仓鼠细胞（CHO）F表达；（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTK血液分子生物学基因治疗目前应用最多、最成功.（3）脂质体法（liposome）（白介2）（肿瘤坏死因子）（5）病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）10天（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体序列和报告基因序列（如GFP)。(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)正常基因的分离与克隆正常基因的分离与克隆磷酸钙磷酸
5、钙+DNA 混合微细颗粒混合微细颗粒 沉淀反应沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露细胞在沉淀物中暴露 524h 方法简单，但转化效率低。方法简单，但转化效率低。DNA脂膜脂膜Xba IBstXIXba IneoXbaIBstXIneo正常基因座位正常基因座位带有珠蛋白基带有珠蛋白基因的质粒因的质粒 重组后，插入外源基因片段带有重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。感染细胞
6、重组病毒导入用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。目前应用最多、最成功.细胞在沉淀物中暴露 524h研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。血液分子生物学基因治疗1、生殖细胞基因治疗为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。缺点需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外
7、源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。4）易于受外源遗传物质转化。三、基因治疗的现状与前景DNA病毒微注射（体外）肿瘤基因治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。一次可获取少者35个，多者十几个。逆转录病毒载体构建的技术路线逆转录病毒载体构建的技术路线 *gag,pol,env gag,pol,env 序列去除，保留序列去除，保留LTR LTR 和和，使使 逆转录病毒成为无复制
8、能力的缺陷病毒。逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。*在在gag,pol,env gag,pol,env 序列去除的区域，插入目的基因序列去除的区域，插入目的基因 序列和报告基因序列（如序列和报告基因序列（如GFP)GFP)。*将目的基因、其两端的将目的基因、其两端的LTR LTR 以及以及这一序列插入这一序列插入 经改造的质粒内。经改造的质粒内。重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。ori 5LTR 目的基因 标记基因 3LTR 抗生素基因卵细胞 去核 细胞*吸附与穿入细胞膜表面的
9、特异性受体。一次可获取少者35个，多者十几个。目前应用最多、最成功.这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。体细胞基因治疗临床实验已经开始，生殖细胞基因治疗正在完善。（1）受精卵受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；DNA 细胞融合 转化细胞*在gag,pol,env 序列去除的区域，插入目的基因经改造的质粒内。导入仓鼠细胞（CHO）F表达；（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞膜细胞膜导入仓鼠细胞（CHO）F表达；1、生
10、殖细胞基因治疗10天缺点需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。胞内装配为成熟的病毒体；体细胞基因治疗临床实验已经开始，生殖细胞基因治疗正在完善。基因治疗的关键性步骤随机插入可能引起后代的基因突变。逆转录病毒(RNA)（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)导入仓鼠细胞（CHO）F表达；1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗微注射（体外）用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。基因治疗（Gen
11、e therapy）1974年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导三、基因治疗的现状与前景仔 鼠LTR LTRPEGDNA病毒*gag,pol,env 序列去除，保留LTR 和，使通过同源重组定点插入珠蛋白基因*吸附与穿入细胞膜表面的特异性受体。Gene表达胞内装配为成熟的病毒体；重组分子 患者T Ly C IL2刺激C分裂表 达1、生殖细胞基因治疗而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。TdR方法简单，但转化效率低。同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。导入（1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进
12、展；病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；即可达到治疗的目的。子，独立于细菌染色体之外进行复制和细胞生长分裂例细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗TIL（体外培养的自体细胞）自杀基因自杀基因(suicide gene)(suicide gene)是一类前体药是一类前体药物转换酶基因，其编码的特异性酶类将原先物转换酶基因，其编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的前体药物在肿瘤细对细胞无毒或毒性极低的前体药物在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，从而达到杀死肿瘤细胞内代谢成毒性产物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。胞的目的。目前研究过的自杀基因有十余种，最常目前研究过的自杀基因有十余种，最常用的
13、是用的是HSV-TK/GCVHSV-TK/GCV和和CD/5-FCCD/5-FC两种自杀基因两种自杀基因系统。系统。药物前体药物前体 无毒无毒Gene酶酶 药物复合物药物复合物 有毒有毒 细胞死亡细胞死亡3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受（5）病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）回输患儿体内*他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来DNA 细胞融合 转化细胞患儿体内ADA水平达正常人的25%（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效随机插入可能引起后代的基因突变
14、。基因治疗的关键性步骤根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。*吸附与穿入细胞膜表面的特异性受体。一次可获取少者35个，多者十几个。（3）脂质体法（liposome）（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体（1）受精卵受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。逆转录病毒有致癌作
15、用，可能使受体细胞癌变。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。回植患者体内研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体正常基因的分离与克隆自杀基因(suicide gene)是一类前体药物转换酶基因，其编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的前体药物在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。（2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至瞬间肿瘤基因治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。序列和报告基因序列（如GFP)。4、自杀基因的基因治疗 X
