1、第五章基因工程载体优选第五章基因工程载体3克隆载体与表达载体克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。4第一 节.质粒 Plasmid质粒是存在于细菌细胞染色体外、能自主复制的小分子环状双链DNA分子。又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。5野生型质粒的大小一般在2200Kb 基因工程常用质粒在24Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。6质粒质粒(plasmi
2、d)71.质粒类型:严紧型质粒(stringent plasmid)15个拷贝/细胞 松弛型质粒(relaxed plasmid):数十个/细胞质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。82.质粒载体必须具备的条件（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。）等。9（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便）具有多个限制性内切酶的单一切点，
3、便于外源基因的插入。如果在这些位点有外于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。活，而便于筛选。10质粒性质不相容性（不亲和性）具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。11以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制.(lysis pathway)个体微小，可以通过细菌滤器氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；严紧型质粒(stringent plasmid)YRP 酵母复制型质粒
4、基因工程常用质粒在24Kb之间属松弛型质粒，拷贝数较多。PGK （磷酸甘油酸激酶）通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos位点。这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。痘苗病毒载体：痘苗病毒是动物病毒中最大的一种，与天花病毒有密切的亲缘关系。3.质粒载体的选择性标记 抗菌素抗性 新陈代谢特性12 抗菌素名称抗菌素名称 抗菌素作用方式抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理宿主菌抗性机理
5、氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）干扰细菌细胞壁合成干扰细菌细胞壁合成 编码编码-内酰胺酶内酰胺酶,切割切割Amp -内酰胺环内酰胺环氯霉素（氯霉素（Cml）抑菌剂抑菌剂,与与50S结合结合,干扰干扰 编码乙酰转移酶编码乙酰转移酶,使使氯霉素氯霉素 蛋白质蛋白质合成合成 乙酰化失活乙酰化失活卡那霉素（卡那霉素（Kan）杀菌剂杀菌剂,与与70S结合结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶编码氨基糖苷磷酸转移酶,发生错读发生错读 修饰修饰Kan失活失活链霉素链霉素（Sm）杀菌剂杀菌剂,与与30S结合结合,mRNA 编码特异修饰酶编码特异修饰酶 发生错读发生错读四环素（四环素（Tet）抑菌剂抑菌剂,与与
6、30S结合，阻止结合，阻止 编码特异蛋白编码特异蛋白,修饰细菌膜修饰细菌膜 蛋白合成蛋白合成 结构结构,阻止阻止Tet通过细胞膜通过细胞膜13复制起点氨苄青霉素抗性基因14常用的质粒载体1.pBR3222.220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。3.pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。151617SV40病毒载体的改建SV40猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40)非受纳细胞SV40感染仓鼠细胞后，不产生感染颗粒，病毒基因组整合到宿主细胞染色体上，细胞被转化（癌变），这种啮齿类动物细胞为SV4
7、0病毒的非受纳细胞。属松弛型质粒，拷贝数较多。根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。缺点：转染效率低于万分之一。氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素逆转录病毒是一类单链RNA病毒。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）
8、潮霉素B磷酸转移酶（HPH）潮霉素B如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。感染效率高，理论上可达100。氨基糖苷磷酸转移酶G418噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。包括 病毒的复制起始区、早期启动子、增强子序列、部分t抗原基因184.融合表达载体如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的蛋白的融合体。19融合表达载体的优点 表达效率高 融合蛋白易纯化 抗GST的蛋白质作为特异性抗体，用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白；可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋
9、白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。20例如加装一段编码IleGluGlyArg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。21QIAexpress 6His表达系统 重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗原。22第二节第二节 噬菌体类噬菌体类 噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名为名为Ba
10、cteriophage,简称简称phage。噬菌体可。噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。23噬菌体（bacteriophage,phage）噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。病毒的特性 个体微小，可以通过细菌滤器 没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成 专性细胞内寄生的微生物 可分为12个科24噬菌体的生物学性状25YRP 酵母复制型质粒可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。Ti质粒进入植物细胞的只
11、是一小部分，约25kb，称为TDNA（transfer DNA）。氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素例如加装一段编码IleGluGlyArg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，从Arg后切开。又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。缺点：转染效率低于万分之一。融合蛋白易纯化 抗GST的蛋白质作为特异性抗体，用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白；（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。如GST融合表达系统。目前应用较广的
12、是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。基因工程常用质粒在24Kb之间SUC （蔗糖酶）不引起宿主细胞的裂解，可建立稳定传代的 细胞株。几乎可感染所有的细胞，缺乏特异性。无致病性；TDNA两端各有一个25bp的正向重复序列，在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对于TDNA的转移和整合是不可缺少的。线性双链DNA病毒，经过改造的腺病毒载体，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。The black bars are size bars representing 100 nm.蛋白质合成 乙酰化失活当培养基中混有氨基喋呤时，会干扰细胞从头合成嘌呤和嘧啶的代谢途径。噬菌体的生物学性状 形态 个体小
13、，需用电子显微镜观察 蝌蚪形、微球形和丝形The black bars are size bars representing 100 nm.262728 用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是噬菌体，另一类是噬菌体，另一类是M13噬菌体。噬菌体。野生型野生型噬菌体经过改造，已衍生出噬菌体经过改造，已衍生出100多多种克隆载体。种克隆载体。噬菌体载体分为插入型和替换噬菌体载体分为插入型和替换型型(置换型置换型)两类。两类。目前应用较广的是目前应用较广的是EMBL系列、系列、gt系列和系列和Charon系列等。系列等。29噬菌体（lambda phage)噬菌体是可以
14、感染细菌的病毒，是大肠杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白外壳蛋白与一个48.5kb的双链线状双链线状DNA分子组成。经过改造形成的噬菌体载体有较高的转化效率。30在在噬菌体DNA分子双链的5端，各有一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内，会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。（cos:cohensive end site)31 3CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3 在黏性末端的12个碱基中，有10个是GC。通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos位点。32 噬菌体基
15、因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。33噬菌体的生长途径 噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。溶原生长途径是指噬菌体的DNA整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时，噬菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。34 溶菌生长是指噬菌体在宿主细胞中黏性末端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋
16、白，新复制的DNA与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。35噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)36M13噬菌体 单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改造后，形成M13mp系列。可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍).M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上的混浊噬菌斑.37噬斑38 单链的M13噬菌体（）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（），成为双链
17、的结构，称为复制型DNA。复制型DNA在细胞内可达200个拷贝。此时，（）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的（）链。只能生成新的（）链。（）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞。39科斯质粒载体（cosmid）又称粘粒载体，简称粘粒。环形双链DNA分子，一般为46Kb。该载体含有DNA的cos序列（不少于280个bp）和pBR322质粒的序列。该载体转化效率高。可容纳高达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制.40 粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。属松弛型质粒
18、，拷贝数较多。4142农杆菌Ti质粒 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。Ti质粒为双链环状DNA分子，200250Kb之间。Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为TDNA（transfer DNA）。43 TDNA两端各有一个25bp的正向重复序列，在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对于TDNA的转移和整合是不可缺少的。利用大肠杆菌质粒与TDNA的部分序列重组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞的基因转移。44第三节 酵母细胞基因工程载体 酵母是最简单的单细胞真核生物。
19、酵母可对表达的多肽链进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、除去N端的甲硫氨酸等。45逆转录病毒是一类单链RNA病毒。包括 病毒的复制起始区、早期启动子、增强子序列、部分t抗原基因发生错读 修饰Kan失活6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。（1）含有能够被真核细胞识别的有效启动子腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）单链DNA,基因组含6407个碱基.噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。pBR322的复制起始区、氨苄青霉素 抗性基因容量小，低于10kb。1 从头合成：利用各种小分子，如氨基酸、CO2、N
20、H3、磷酸核糖等，合成嘌呤或嘧啶环，进而合成核苷酸。胸苷激酶（TK）APT（氨基喋呤）2 补救合成途径：利用细胞内原有的或从胞外吸收的碱基、核苷、核苷酸。pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。由于酵母菌对许多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。卡那霉素（Kan）杀菌剂,与70S结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶,The black bars are size bars representing 100 nm.从头合成途径：利用小分子重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。酵母菌的克隆载体YIP 酵母整合型质
21、粒YRP 酵母复制型质粒YEP 酵母附加子型载体CIP 酵母菌着丝粒型质粒46上述质粒均可在大肠杆菌和酵母菌中稳定存在，即所谓的穿梭质粒穿梭质粒。这些质粒含有两种可供筛选的选择性标记。47YIp载体URA3 乳清苷酸脱羧酶48 酵母菌表达载体1.选择性标志 当使用大肠杆菌做为宿主细胞时，多使用抗生素抗性作为筛选标志。由于酵母菌对许多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。野生型基因URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1（色氨酸）这些基因可补偿酵母菌细胞中某一种特定的代谢缺陷（营养缺陷）492.启动子含有可被RNA聚合酶II识别的酵母启动子 GAL、GAL10（半乳糖激酶）PHO5（碱性磷
22、酸酶）ADH（醇脱氢酶）TP1 （丙糖磷酸异构酶）PGK （磷酸甘油酸激酶）GAP（磷酸甘油醛脱氢酶）SUC （蔗糖酶）50注释：细胞内某些蛋白质丰度较高，如PGK （磷酸甘油酸激酶）、GAP（磷酸甘油醛脱氢酶），各占细胞总蛋白的5%，属于高含量的蛋白质，它们的启动子为强启动子。51酵母分泌型表达载体 这类载体可以使目的蛋白分泌到细胞外。载体内除含有一般表达质粒的必要成分外，还需有一个控制蛋白质分泌的信号序列。其编码的多肽链叫做信号肽。信号肽内多含疏水性氨基酸。52第四节 哺乳动物细胞表达载体53病毒侵入动物细胞后，有两种生长状态 溶细胞感染 病毒在宿主细胞内合成自身的核酸和结构蛋白，装配成完
23、整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，宿主细胞因为代谢障碍而死亡。整合性感染 病毒核酸整合到宿主细胞的染色体中，随细胞DNA的复制而扩增。54病毒载体 （1）含有能够被真核细胞识别的有效启动子 （2）在感染周期中能够持续复制，达到很高的拷贝数。（3）控制自己复制的元件 （4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上 （5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。551.SV40病毒病毒载体载体SV40猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40)环型双链DNA分子，含5243bp。优点1.感染率高；2.拷贝数高；3.转录产物 高；缺点1.宿主范围窄；2
24、.最终导致感染细胞死 亡；3.制备耗时，成本较高。56SV40病毒载体的改建病毒的部分序列质粒的部分序列 如PSV2 包括 病毒的复制起始区、早期启动子、增强子序列、部分t抗原基因 pBR322的复制起始区、氨苄青霉素 抗性基因57病毒质粒载体病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质粒分子重组而成。例如pC10早期区段和复制起点（多瘤病毒）质粒pBR322的部分区段 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。58信号肽内多含疏水性氨基酸。卡那霉素（Kan）杀菌剂,与70S结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶,SV40病毒载体的改建6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质
25、的结构和功能，无需切除。受纳细胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴细胞后，产生感染性病毒颗粒，并使宿主细胞裂解，这种感染称为裂解感染，而猿猴细胞则称为受纳细胞。其编码的多肽链叫做信号肽。重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。又称粘粒载体，简称粘粒。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。野生型质粒的大小一般在2200Kb环型双链DNA分子，含5243bp。卡
26、那霉素（Kan）杀菌剂,与70S结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶,免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；（lambda phage)QIAexpress 6His表达系统容量小，低于10kb。CCCGCCGCTGGAThe black bars are size bars representing 100 nm.胸苷激酶（TK）APT（氨基喋呤）改造后的病毒优缺点 优点：优点：1.不需病毒颗粒的包装过程，故可插入较大长 度的DNA片段。2.不引起宿主细胞的裂解，可建立稳定传代的 细胞株。3.整合到宿主细胞的染色体中，重组基因不会丢失。缺点：转染效率低于万分之一。59受纳细胞：SV40感染C
27、V-1或AGMK猿猴细胞后，产生感染性病毒颗粒，并使宿主细胞裂解，这种感染称为裂解感染，而猿猴细胞则称为受纳细胞。60非受纳细胞SV40感染仓鼠细胞后，不产生感染颗粒，病毒基因组整合到宿主细胞染色体上，细胞被转化（癌变），这种啮齿类动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞。61逆转录病毒载体逆转录病毒是一类单链RNA病毒。宿主范围广，感染动物或人的细胞。感染效率高，理论上可达100。具有强启动子。不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代存在问题1.容量小，低于10kb。2.可能引起细胞癌变。62腺病毒载体（AV）线性双链DNA病毒，经过改造的腺病毒载体，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。63 优点基因组
28、大，可插入大片段的外源基因，最多可 达 35kb；可高效的感染不同类型的人体组织细胞；进入细胞内不整合进宿主的基因组，仅瞬间表达。缺点 免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；几乎可感染所有的细胞，缺乏特异性。64腺相关病毒载体（AAV）：属于非致病的微小 病毒科家族的成员，只有依赖于辅助病毒才能繁殖。特点：基因组小，只有几个kb；无致病性；免疫原性弱；装载外源基因容量小，不超过5kb；制备过程复杂 ；65痘苗病毒载体：痘苗病毒是动物病毒中最大的一种，与天花病毒有密切的亲缘关系。长期被用作预防天花的疫苗。病毒基因组中有很大的非必需区（28kb），可以切除，代之以较大的外源基因，或者同时插入几个外源
29、基因，构成多价疫苗。66哺乳动物细胞基因转移的选择标记 氨基糖苷磷酸转移酶G418 二氢叶酸还原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤）胸苷激酶（TK）APT（氨基喋呤）潮霉素B磷酸转移酶（HPH）潮霉素B 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）霉酚酸 腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）67嘌呤和嘧啶合成知识的回顾 哺乳动物细胞内的两条合成途径1 从头合成：利用各种小分子，如氨基酸、CO2、NH3、磷酸核糖等，合成嘌呤或嘧啶环，进而合成核苷酸。2 补救合成途径：利用细胞内原有的或从胞外吸收的碱基、核苷、核苷酸。681.从头合成途径：利用小分子合成核苷酸，包括胸苷酸2.补救合成途径：利用细胞内现有的碱基、磷酸
30、合成核苷酸，包括胸苷酸氨甲喋呤可阻挡此途径胸苷激酶等69如PSV2蛋白质合成 乙酰化失活病毒的部分序列质粒的部分序列优选第五章基因工程载体又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。属松弛型质粒，拷贝数较多。合成核苷酸，包括胸苷酸GGGCGGCGACCT免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；环型双链DNA分子，含5243bp。哺乳动物细胞基因转移的选择标记又能像DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名为Bacteriophage,简称phage。例如加装一段编码IleGluGlyArg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，从Arg后切开。在黏性末端的12个碱基中，有10个是GC。几乎可感染所有的细胞，缺乏特异性。可高效的感染不同类型的人体组织细胞；PGK （磷酸甘油酸激酶）质粒载体的选择性标记当培养基中混有氨基喋呤时，会干扰细胞从头合成嘌呤和嘧啶的代谢途径。TK+细胞可利用环境中的胸苷合成胸苷一磷酸，由此可以存活。而TK-细胞不能利用环境中的胸苷合成胸苷一磷酸，因而死亡。
