1、实验四实验四 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳检测检测DNA一、实验目的一、实验目的l通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，检测上次实验课提取的质的方法和技术，检测上次实验课提取的质粒粒DNA二、实验原理二、实验原理l带电物质在电场中的趋向运动称为带电物质在电场中的趋向运动称为。凝胶电泳由于其。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法的首选标准方法是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子
2、所带的电荷密度、电质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率包括包括样品的物理性状样品的物理性状、支持物介质支持物介质、电电场强度场强度和和缓冲液离子强度缓冲液离子强度lDNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶和和聚丙聚丙烯酰胺凝胶烯酰胺凝胶关于电泳关于电泳琼脂糖凝胶电
3、泳琼脂糖凝胶电泳l琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度lDNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有分子在琼脂糖凝胶中泳动时有和和l在碱性缓冲液中在碱性缓冲液中DNADNA分子带分子带，在外加电场作用下向正极，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链链DNADNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动极方向移
4、动l在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，分子的迁移速度取决于分子筛效应，即即DNADNA分子本身的大小和构型分子本身的大小和构型l琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNADNA，也可，也可以分离相对分子质量相同，但以分离相对分子质量相同，但的的DNADNA分子分子l可以分离长度为可以分离长度为的的DNADNA分子，常采用分子，常采用TAETAE、TBETBE和和TPETPE三种缓冲体系三种缓冲体系：即溴化乙锭，它能够插入：即溴化乙锭，它能够插入DNADNA分子中的碱基分子中的碱基对之间而与对之
5、间而与DNADNA结合。由于结合。由于EBEB分子的插入，在紫外分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的光的照射下，凝胶电泳中的DNADNA条带呈现出红色荧条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测光，易于检测。可以检测10ng 10ng 的的DNADNA注意：注意：EBEB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套必须戴塑料或乳胶手套:是一种可代替是一种可代替EBEB的新型核酸染料，采的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测用琼脂糖电泳检测DNADNA时，时，GoldViewGoldView与核酸结合后与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与
6、能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与EBEB相当，相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNADNA呈呈现绿色荧光，而且也可用于染现绿色荧光，而且也可用于染RNARNA。DNADNA的染料的染料线性线性DNADNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系琼脂糖凝胶的百分浓度分离线性DNA片段分离的有效范围(kb)0.360 50.620 10.710 0.80.97 0.51.26 0.41.54 0.22.03 0.1聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由聚丙烯酰
7、胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由单体和交联剂单体和交联剂在催化剂在催化剂过硫酸铵过硫酸铵和加速剂和加速剂TEMED的作用下聚合而成的作用下聚合而成l可以分离小片段（可以分离小片段（）DNA分子分子l聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定在在pHpH值为值为8.0-8.38.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，离，磷酸全部解离，核酸分子带核酸分子带，在电泳，在电泳时向正极移动时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在质作
8、为电泳支持物，在作用下，作用下，使分子使分子大小和构象不同大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入的。核酸分子中嵌入荧光染料荧光染料（如（如EBEB）后，在）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验原理实验原理三、仪器、材料与试剂三、仪器、材料与试剂l微波炉微波炉l琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统l紫外线透射仪紫外线透射仪l质粒质粒DNAlDNA markerl50TAEl6凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液l琼脂糖琼脂糖l1溴化乙
9、锭溶液溴化乙锭溶液溶解琼脂糖分离质粒DNA片段检测质粒DNA片段电泳样品DNA相对分子质量标准物电泳缓冲液沉降DNA并起指示作用电泳支持介质嵌入DNA中，在紫外灯下显色四、实验步骤四、实验步骤1.装好制胶装置装好制胶装置用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好好(一定封严，不能留缝隙一定封严，不能留缝隙),使用使用将胶板调将胶板调至水平，至水平，适当梳子适当梳子2.将将1g 琼脂糖加入琼脂糖加入100ml 1TAE中，摇中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到，加入，加入l的的1 EB，并摇匀），则为，并摇匀），则为琼
10、脂琼脂糖凝胶液糖凝胶液3.将溶解的琼脂糖（约将溶解的琼脂糖（约50）倒入倒入，室温冷却凝固，室温冷却凝固4.充分凝固后充分凝固后撕掉两端的胶撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中布，将凝胶置入电泳槽中(注意：注意：DNA样品孔应朝向样品孔应朝向负电极一端负电极一端)，加加至液面覆盖凝至液面覆盖凝胶胶0.5cm5.用移液器吸取质粒样品用移液器吸取质粒样品5l于封口膜上，再加入于封口膜上，再加入1l 的的6，混匀后，小心加入点样孔，混匀后，小心加入点样孔 (记录电样的顺序和电样量记录电样的顺序和电样量)6.打开电源开关，调节电压至打开电源开关，调节电压至35V/cm，可见溴酚蓝条，可见溴酚蓝条带由负极
11、向正极移动带由负极向正极移动(注意注意DNA片段从负极向正极移片段从负极向正极移动动)7.当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳处，停止电泳8.将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在存在处显出桔红色荧光条带（处显出桔红色荧光条带（注意：紫外线对眼睛有伤害注意：紫外线对眼睛有伤害作用，应戴上防护眼睛作用，应戴上防护眼睛）每班每班4组，约组，约30人人每组每组7人：人：1套琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、套琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、8孔梳子），孔梳子），20L
12、或或10L移液枪移液枪1支，冰盒支，冰盒1个，个，50mL锥锥形瓶形瓶1个（贴上个（贴上EB标签）。标签）。每班配每班配2台电炉，线手套台电炉，线手套2副。副。五、思考题五、思考题lEB的中文名称是什么？使用的中文名称是什么？使用EB时应注意些什么？时应注意些什么？l怎么制备一块怎么制备一块20mL体积体积1琼脂糖凝胶（含溴化乙琼脂糖凝胶（含溴化乙锭溶液终浓度锭溶液终浓度0.5g/mL）？）？l什么是什么是Loading Buffer？Loading Buffer中含有哪些中含有哪些成分？各组分的作用是什么？成分？各组分的作用是什么？1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使，否则温度太高会使制板变形制板变形2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔坏点样孔3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多4 EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔5 紫外线照射不要太久紫外线照射不要太久注注 意意凝胶电泳槽凝胶电泳槽
