1、第六章真核基因在大肠杆菌中的表达l大肠杆菌表达体系l克隆基因正确表达的基本条件l克隆基因表达活性的检测 1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架 2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。优越性：优越性：大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细
2、菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系大肠杆菌中表达体系的不足大肠杆菌中表达体系的不足4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 最基本条件应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。重要条件编码的蛋白质产
3、物应能维持正常的稳定性。克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；插入序列的正确取向。克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件1.微细胞检测法；微细胞检测法；2.2.巨细胞检测法；巨细胞检测法；3.3.偶联反应测定法。偶联反应测定法。克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测 这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。微细胞指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。微细胞检测法微细胞检测法克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测 通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开，含有质粒载体的微细
4、胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测最佳启动子具备的条件pOK1质粒载体分离功能启动子的因素细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；噬菌体的阻遏物操作系统接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开，含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。微细胞指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小
5、的圆形的无核细胞。启动子封堵作用由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的、或是应用DNA重组技术构建的、一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因影响其形成的关键因素电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。影响其形成的关键因素电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的、或是应用DNA重组技术构建的、一类具有来自两
6、个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因可以控制具有转译起始区的外源片断插入基因的表达。不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。Example:Example:ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）,在微细胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测巨细胞检测法巨细胞检测法 1.经紫外线照射的大肠杆
7、菌recA uvrA细胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照射后6小时，细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右，在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测 2.将含有外源基因的噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤，自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测偶联反应测定法偶联反应测定法 使DNA模板在细菌无细
8、胞体系中，进行转录转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测 优点优点 1.1.放射性标记参入到蛋白质的效率，比放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记法高的多，而且这个系统十体内标记法高的多，而且这个系统十分敏感。经分敏感。经35S35S标记的多肽分子，通过标记的多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出；干小时后可被迅速检出；2.2.应用这个体系，其它原核生物的基因应用这个
9、体系，其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。也能够得到有效的表达。go大肠杆菌表达载体外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体（Inclusion Bodies，IB）简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码半乳糖苷酶的lacZ基因片断。经pMK20质粒转移而来。将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。克隆基因表达活性的检测基因编码区5 端若干密码子的碱基序列构建Ecoli基因文库将含有外源基因的噬菌体重组子，感
10、染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。pBR322的HaeEcoR片断；pOK1质粒载体分离功能启动子的因素将此片断，克隆到pBR322质粒的Hind 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个Hind 位点）。影响其形成的关键因素电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；克隆基因正确表达的基本条件微细胞指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用通过同噬
11、菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。核糖体结合位点核糖体结合位点启动子启动子转录终止子转录终止子复制复制起点起点组组 成成 部部 分分 最佳启动子具备的条件 第一 必须是启动子能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%30%以上 1.1.启动子启动子第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。（IPTG）乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性的可控性 野生型的Plac与其
12、控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高PO基地水平转录基地水平转录阻遏蛋白阻遏蛋白乳糖乳糖 异丙基异丙基D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷IPTG 诱导诱导高效转录高效转录PO乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性的可控性野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5cAMPCAP高效转录高效转录Placo葡萄糖
13、代谢葡萄糖代谢cAMP浓度降低浓度降低Placo基底水平转录基底水平转录PlacUV5o高效转录高效转录 启动子封堵作用由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。2.转录终止子转录终止子强化转录终止的必要性：强化转录终止的必要性：外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因
14、的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去Hind部分酶切消化，将
15、靠近EcoR1位点的一个Hind 位点，经核酸外切酶 和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED51.密码子使用的偏爱性现象的规律性区同寄主细胞的诱导型启动子构成细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型mRNA转译终止必须存在终止密码子。真核基因的转录信号同原核的不同。将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。二、由一种异源蛋白质基因的编码序列显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。周质在
16、大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；pOK1质粒载体分离功能启动子的因素克隆基因表达活性的检测（42度，拷贝数提高510倍）为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。转化galE+、galT+、
17、galK-的大肠杆菌受体菌株 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用 终止子也可以通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用筛选筛选Apr、Tcs的转化子的转化子3.3.核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高
18、达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；
19、SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区5 端若干密码子的碱基序列4.转译增强子转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。5.5.转译终止子转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA，接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置1.随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因
20、的表达活性。功能启动子的分离：功能启动子的分离：1.一般程序：一般程序：报告基因（reporter gene）特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据利用利用CAT基因基因进行功能启动子进行功能启动子的分离和活性测定的分离和活性测定2.2.无启动子的无启动子的CATCAT质粒载体质粒载体Ecoli DNA构建构建EcoliEcoli基因文库基因文
21、库细胞裂解物、细胞裂解物、1414C C标记得氯霉素标记得氯霉素乙酰辅酶乙酰辅酶A A薄层层析薄层层析放射自显影放射自显影CAT活性的检测：活性的检测：氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶可以催化氯霉素（可以催化氯霉素（2-或或3-）发生乙酰化作用。发生乙酰化作用。3.使用tetr作报告基因分离功能启动子 1.首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（pBRH3B,pBRH1），使之失活。2.将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。
22、4.使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。来源于来源于pBR322pBR322转译终止密码子转译终止密码子无启动子的无启动子的galK原理 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖1磷酸。用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。分离功能的启动子 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上；将体外连接的DNA重组分子，转化给具Ga
23、lE、GalK 的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰；将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆启动子的筛选启动子的筛选pOK1pOK1质粒载体分离功能启动子的因素质粒载体分离功能启动子的因素 1
24、.选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）；2.应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。3.采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK）作转化受体；5.启动子的构建启动子的构建Ptac=3 Ptrp=11 Plac 1.Lac启动子的表达载体 2.Trp启动子的表达载体 3.PL启动子的表达载体常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体 理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条
25、足够大的编码半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，人保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）Trp启动子的表达载体外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位可以催化氯霉素（2-或3-）具有克隆基因的功能（强）启动子；在MS2聚合酶基因下游，存在BamH和Hind 单切点。克隆基因表达活性的检测目的蛋白稳定性高，重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的10倍报告基因（report
26、er gene）大肠杆菌细胞中的表达具有ColE1复制起点的Hae 片断它们的功能往往是异常的，或者是已经发生了变化由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK）作转化受体；将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量
27、表达。将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。酶促裂解法：单残基位点大肠杆菌染色体DNA的5.1.经过Hae 切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、半乳糖苷酶的头8个密码子。有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体2.95bp的Alu片断不完整的CAP结合序列3.L8突变的203bp区段，在CAP结合序列里发生了GA的转换4.在uv5突变，使lac启动子开始的转录显得更有效。（RNA聚合酶结合区TA颠换,相邻碱基GA的转换）质粒的
28、构建 将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。增加增加2个碱基对个碱基对2.Trp启动子的表达载体 这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。构建 1.大肠杆菌染色体DNA的5.4kb Hind 片断，含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。2.将此片断，克隆到pBR322质粒的Hind 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个Hind 位点）。3.Hind部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个Hind 位点，经核酸
29、外切酶 和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED51.使用Hind 接头，将ptrpED51质粒的Hinf1片断克隆到了pBR322质粒的Hind 位点上，形成重组质粒pWT111（含有trp调节序列和trpE基因的头7个密码子）。lTrp启动子表达载体已用来生产了干扰素和干扰素l三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元3.PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一。噬菌体的阻遏物操作系统噬菌体的阻遏物操作系统cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。42度时，阻遏蛋白失活；2830度时，PL启动子完全被阻遏蛋白抑制 通过改变温度来控制PL启动子的开闭具有克隆基
30、因的功能（强）启动子；特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。葡萄糖代谢使cAP减少，也能阻遏Plac介导的转录。周质在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。将含有外源基因的噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。乳糖启动子Plac的可控性构建Ecoli基因文库将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上
31、。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，人保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。周质在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。克隆基因表达活性的检测核糖体结合位点对外源基因表达的影响影响其形成的关键因素电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。区同寄主细胞的诱导型启动子构成核糖体结合位点对外源基因表达的影响增进了蛋白质的折
32、叠作用外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。（42度，拷贝数提高510倍）构建Ecoli基因文库pPLc24表达载体 用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。这个质粒表达载体含有MS2聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。在MS2聚合酶基因下游，存在BamH和Hind 单切点。EcoR单切点靠近 PL启动子，处于转译起始密码子之前。pPLa2311表达载体 可以控制具有转译起始区的外源片断插入基因的表达。这种启动子可接受热敏感的阻遏蛋白质的抑制。组成 1.pBR322的HaeEcoR片断；
33、编码ampr 2.噬菌体的Hae Hae片断 PL 3.pMK20质粒的Hae片断编码kanr 4.具有ColE1复制起点的Hae 片断 经pMK20质粒转移而来。pPLc2833表达载体 调节型强启动子能够使克隆的真核基因在大肠杆菌寄主细胞中最有效的高水平表达 组成组成 1.1.一个调节型的强启动子；一个调节型的强启动子；2.2.一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因amprampr；3.3.一个直接位于一个直接位于PLPL启动子下游的多克隆位点启动子下游的多克隆位点（MCSMCS）区）区 若由pKN402质粒的DNA复制起点取代pPLc2833质粒的DNA
34、复制起点，由此形成的新质粒pCP3。它在大肠杆菌寄主细胞中指导外源蛋白质合成的有效性可得到有效的提高。而且这种质粒是温度敏感型的载体。（42度，拷贝数提高510倍）go克隆的真核基因在克隆的真核基因在 大肠杆菌细胞中的表达大肠杆菌细胞中的表达l外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位l融合蛋白质的表达1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达1.外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位遗传密码子的使用对基因表达效率的影响它们的功能往往是异常的，或者是已经发生了变化克隆基因表达活性的检测4kb Hind 片断，含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpE基因
35、、trpD基因的部分序列。构，以增强其转录终止作用密码子使用的偏爱性现象的规律性这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂基因编码区5 端若干密码子的碱基序列蛋白质N-末端的结构真实不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。将含有外源基因的噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。在
36、周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。5UTR对克隆基因表达效率的影响还原的环境不利于二硫键的形成2830度时，PL启动子完全被阻遏蛋白抑制克隆基因表达活性的检测第一 必须是启动子能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%30%以上细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体（Inclusion Bodies，IB）包涵体存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分优点1.形成包涵体 a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b.
37、蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害2.蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。3.表达的质粒载体构建比较简单。缺点 1.包涵体 a.蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b.蛋白质的终产量偏低 c.蛋白质的生产成本比较昂贵 2.还原的环境不利于二硫键的形成 （硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统）3.由于N末端存在甲硫氨酸。使蛋白质的真实性受影响4.蛋白质会被酶解5.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂 周质中表达 周质在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在
38、周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。优点 1.由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单 2.蛋白质酶解的程度不甚严重 3.促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去4.蛋白质N-末端的结构真实分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达蛋白质
39、的分泌机制蛋白质的分泌机制 原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感缺点 1.信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2.有可能形成包涵体胞外表达 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化途径 1.用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）2.诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌（可以分离到中等产量的蛋白质）优
40、点 1.蛋白质的酶解作用程度低 目的蛋白稳定性高，重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的10倍 2.由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化 3.增进了蛋白质的折叠作用 缺点 1.在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的 2.由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂2.融合蛋白质的表达 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于
41、C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白一、由报告基因的编码序列区和另一个 基因的启动子及其调节序列构成的二、由一种异源蛋白质基因的编码序列 区同寄主细胞的诱导型启动子构成由由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型体外重组构成的融合基因有两种类型 融合蛋白质由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。它们的功能往往是异常的，或者是已经发生了变化融合基因：融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的、或是应用DNA重组技术构建的、一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列
42、的新型基因 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：1.化学断裂法2.酶促裂解法化学断裂法化学断裂法 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸甲硫氨酸残基侧链的硫醚基硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收
43、率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法酶促裂解法：酶促裂解法：单残基位点单残基位点 蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分
44、子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的多残基位点多残基位点 为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物go影响克隆基
45、因在大肠杆菌中的表达效率因素5UTR对克隆基因表达效率的影响 a.启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的保守序35区（5TTGACA）和10(5TATAAT)区;它们之间的距离(17bp)b.启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 当mRNA分子5末端与SD序列之间的长度小于15bp时，转译效率下 2.质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 a.质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b.质粒载体的不稳定性对表达效率的影响质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩
46、增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制 pCP33拥有一个温度可诱导型的复制子在28时，每个细胞的质粒拷贝数为60在4422时，拷贝数迅速增至300-600在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 a.转译起始序列
47、对表达效率的影响 b.mRNA的稳定性对表达效率的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响：序列的影响：一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低 SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这
48、个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍SD序列与起始密码子之间的序列的影响：序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列与起始密码子之间的距离的影响：序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了RNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低起始密码子及其后续若干密码子的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始tRNA分
49、子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a.密码子使用的偏爱性现象的规律性 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子；一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种
50、同义密码子，CCC是优先使用的）高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量生物基因组中的碱基含量 在富含ATT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中
