1、单纯酶 催化活性仅由酶蛋白部分决定结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子 活性部位 辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物金属激活剂 金属离子作为辅助因子结合基团 专一性催化基团 催化性质维持酶空间结构优点：优点：（1）可提高稳定性。）可提高稳定性。（2）能回收，易与产物分离，可反复使）能回收，易与产物分离，可反复使 用。用。（3）利用效率高）利用效率高缺点：缺点：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。酶活性下降。固定化方法固定化方法吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微
2、囊型离子交离子交换吸附换吸附物理物理吸附法吸附法 1.吸附法（吸附法（adsorption）根据吸附剂的特点分:（1）物理吸附法作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。（2）离子结合法作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素2.共价偶联法共价偶联法 借助共价键将酶借助共价键将酶的活性非必需侧的活性非必需侧链基团和载体的链基团和载体的功能基团进行偶功能基团进行偶联。联。（1）载体：亲水载体优于疏水载体）载体：亲水载体优于疏水载体 如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和
3、性好，机械性能差亲和性好，机械性能差琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构尼龙尼龙（2）偶联方法：）偶联方法：偶联成功与否取决于：偶联成功与否取决于：载体：功能基团（芳香氨基，羧基，羧甲载体：功能基团（芳香氨基，羧基，羧甲基等）基等）酶分子：侧链非必需基团（羧基，巯基，酶分子：侧链非必需基团（羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基）羟基，酚基，咪唑基）常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。溴化氰法、烷基化法等。优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，优点：酶与载体
4、结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。构象而影响酶的催化活性。3.交联法交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。的固定化方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O O H C CH2 CH2 CH2 C H戊二醛有两个醛基，戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的均可与酶或蛋白质的游离氨基反应游离氨基反应,使酶使酶蛋白交联蛋白交联。此法与共价偶联法利此法与共价偶联法利用的均是共价键，用的均是共价键，不不同之处：同之处：交联法
5、不使交联法不使用载体。用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。持溶解状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。不溶态。缺点：缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。不便。4.包埋法（包埋法（entrapment）将酶用物理的方法包将酶用物理的方法包埋在各种载体
6、（高聚埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型：将酶包埋在网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格高分子凝胶细微网格中。中。微囊型：将酶包埋在微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。高分子半透膜中。1）网格型包埋法）网格型包埋法又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法 使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法：滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法：滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
7、APAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED2）微囊型包埋法）微囊型包埋法又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内内。半透膜：直径几十微米到几百微米，。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约厚约25nm。半透膜孔径半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称的小分子底物和产物可以自由进出，被称为为“人工细胞人工细胞”。与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩）固定化酶颗粒小，
8、有利于底物和产物扩散。散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。的医学价值。缺点：反应条件要求高缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。制备成本也较高。包埋法是目前应用最多的一种较理想的方包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。改变酶的高级结构，酶活回收率高
9、。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。酶。吸附法吸附法 共价偶联法共价偶联法 交联法交联法 包埋法包埋法 酶的四种固定化方法酶的四种固定化方法各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较海藻胶溶液酿酒酵母 CaCl2喷珠机酵母酶珠优点：方法简单 颗粒比表面积大 转化效率高适合于各种类型反应器 经过固定化后，酶的一些特性如：经过固定化后，酶的一些特性如：均可能发生变化。均可能发生变化。间隙搅拌间隙搅拌罐反应器罐反应器连续流动搅连续流动搅拌罐反应器拌罐反应器填填充充床床反反应应器器流流化化床床反反应应器器连续流动连续流动搅拌罐搅拌罐超滤反应超滤反应器
10、器循环反循环反应器应器 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。常用方法：原料中引入溶液。常用方法：提取目标：提取目标：a.将目的酶最大限度地溶解出来。将目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（一般采用低温下（010）操作。）操作。离心分离：离心分离：基本原理基本原理（1）.离心力离心力Fc=m ac m r 2 m r（2 N/60）2
11、N为离心机每分钟转数为离心机每分钟转数（r/min）；）；Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力）表示，即离心力F的大小相当于地球引力的大小相当于地球引力（重力常数（重力常数g）的多少倍。一般用）的多少倍。一般用g（或数字（或数字 g）表示。表示。RCF=m r（2 N/60）2/mg=1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用旋转半径用r平均代替平均代替 r平均平均=1/2（r大大+r小）小）cm通常：通常：低速离心以低速离心以每分钟的转数每分钟
12、的转数表示，如：表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以高速离心（超速），常以相对离心力相对离心力（RCF）表）表 示，如：示，如：65000g。两者可换算或查测算图。两者可换算或查测算图。计算近似计算近似RCF的列线图的列线图（2）.沉降系数沉降系数:（sedimentation constant）指单位离心力下颗粒的沉降速度（指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity），用），用S表示。表示。由于许多生物大分子的由于许多生物大分子的S值很小，所以定义值很小，所以定义10 13 s 为一个沉降单位，为一个沉降单位，1S=1 10 13 s。常用常用
13、S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在，蛋白质的沉降系数一般在1 200之间。之间。（3）.离心机的种类离心机的种类按离心机转速的不同，按离心机转速的不同，分为：分为：常速（低速）常速（低速）高速高速超速超速 离心机的种类离心机的种类l温度类型：温度类型：常温及常温及冷冻冷冻l超速离心机均为冷超速离心机均为冷冻型。冻型。l使用冷冻离心机时使用冷冻离心机时提前降温，预冷离提前降温，预冷离心头。心头。l使用超速离心机时使用超速离心机时先抽真空。先抽真空。角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式及外摆式：外摆式一
14、般为低速，角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。作注意稳、盖、旋紧。l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离强度：和离心速度相配心速度相配l大小：和转大小：和转子配套子配套l高速超速管高速超速管要加盖要加盖l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。常用离心方法常用离心方法 差速离心法差速离心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度离心密度梯度离心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度离心等密度梯度离心（1）差速离心）差速离心（differential centrifugation）采用不同的
15、离心速度和离心时间，使沉降速度采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。不同的颗粒分批分离的方法。特点：特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：优点：操作简单操作简单。缺点：缺点：1）分离效果较差，）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重。）壁效应严重。3）沉降的颗粒受到挤压）沉降的颗粒受到挤压。差速离心分离示意图差速离心分离示意图（a a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b b）（）（e e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况（2）密度梯度离心）密度梯度离心（density
16、 gradient centrifugation）样品在样品在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗糖溶液。溶液。特点：特点：区带内的液相介质密度小于样品物质区带内的液相介质密度小于样品物质 颗粒的密度。颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。密度梯度离心密度梯度离心示意图示意图 （a a）离心前）离心前 （b b）离心后）离心后（3）.等密度梯度离心等密度梯度离心 又称又称沉降平衡离心沉降
17、平衡离心（sedimentation equilibrium centrifugation）。）。根据根据颗粒的密度不同颗粒的密度不同而进行分离。而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。常用其相同的密度时不再移动，形成区带。常用氯化氯化铯铯（CsCl）作为梯度介质。）作为梯度介质。特点：特点：介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。适于
18、分离沉降系数相近，但密度不同的物质。等密度梯度离等密度梯度离心示意图心示意图（a a）离心前；）离心前；（b b）离心后）离心后 沉降速度离心和沉降平衡离心的特点沉降速度离心和沉降平衡离心的特点总结：总结：等密度梯度离心等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择学方法，关键在于选择氯化铯氯化铯浓度，使之包括待浓度，使之包括待分离物的密度范围。分离物的密度范围。差速离心差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的于各分离物的离心力离心力。密度梯度离心密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的于制备优质的密度梯度密度梯度溶液。溶液。酶纯化的基本原则：酶纯化的基本原则：建立一个方便灵敏的分析方法；建立一个方便灵敏的分析方法；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；常在低温（常在低温（4）条件下进行纯化，以避免酶的）条件下进行纯化，以避免酶的变性。变性。酸解、过滤水、盐酸45-48,3-4h脱脂除杂氯仿或乙醚24-28h浓缩干燥40以下培养固定转化过滤抽提3%青霉素GNaOH调节至7.5-7.84070L/min固定化E.coli循环3-4h
