1、第一章第一章 分光光度技术分光光度技术p1 分光光度法（分光光度法（Spectrophotometry）：）：它是根据物质对不同波长的光线具有选择性它是根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（为吸收光谱法（Absorption spectrometry）。）。它不需要我们把欲分析的样品从混合物中分离它不需要我们把欲分析的样品从混合物中分离开来，即可利用样品特殊的吸收峰或特殊的显开来，即可利用样品特殊的吸收峰或特殊的显色反应，直接
2、进行定性、定量的分析色反应，直接进行定性、定量的分析。第一节第一节 基本原理基本原理 一、光的基本知识一、光的基本知识 光是由光量子组成的，具有二重性，即不连光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示：的波动性的特征，可用下式表示：C 为波长，为波长，为频率，为频率，c为光速，等于为光速，等于299 7704kms。第一节第一节 基本原理基本原理 入射光的强度为入射光的强度为Io，通过厚，通过厚度为度为L的溶液后，透射光的强的溶液后，透射光的强度为度为It，称为透光度称为透光度（transm
3、ittance），用），用T表示。表示。lg 称为吸光度称为吸光度A(Aabsorbance A)，又称为消，又称为消光度光度(degree of extinction E)或光密度或光密度(optical density D)。图1-1 光吸收示意图0ItItIoI第一节第一节 基本原理基本原理 二、二、朗伯一比尔朗伯一比尔(1ambertBeer)定律定律 AKLC 它表示溶液的吸光度与溶液浓度和液它表示溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。层厚度的乘积成正比。第一节第一节 基本原理基本原理三、吸光系数三、吸光系数 吸光系数的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度吸光系数的物理意义
4、是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。时的吸光度。1.摩尔吸光系数摩尔吸光系数:指指1摩尔浓度的溶液在厚度为摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时，时，在某一特定波长下的吸光度，用在某一特定波长下的吸光度，用或或EM表示。表示。2.百分吸光系数百分吸光系数 其意义指某物质的其意义指某物质的1%（W/V）浓度的）浓度的溶液，在厚度为溶液，在厚度为1cm时，在某一特定波长下的吸光度，用时，在某一特定波长下的吸光度，用E1%来表示。来表示。两种吸光系数表示方式之间的关系是两种吸光系数表示方式之间的关系是 E1%10M第二节第二节 分光光度计的基本类型和组件分光光度计的基本类型和组件一、一、分分光光度计的
5、基本类型光光度计的基本类型1:单光束分光光度计单光束分光光度计 2:双光束分光光度计双光束分光光度计3:二极管距阵分光光度计二极管距阵分光光度计 4:双波长分光光度计双波长分光光度计第二节第二节 分光光度计的基本类型和组件分光光度计的基本类型和组件 一、一、光光度计的基本类型光光度计的基本类型图图1-2 各种类型分光光度计的结构示意图各种类型分光光度计的结构示意图A:单光束分光光度计单光束分光光度计 B:双光束分光光度计双光束分光光度计C:二极管距阵分光光度计二极管距阵分光光度计 D:双波长分光光度计双波长分光光度计第二节第二节 分光光度计的基本类型和组件分光光度计的基本类型和组件二、分光光度
6、计的基本组件二、分光光度计的基本组件（一）光源一）光源:常用的有白炽灯（钨丝灯、卤钨灯等），气体放电灯常用的有白炽灯（钨丝灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。多种。（二）分光系统（二）分光系统(单色器单色器):有棱镜及光栅两种类型。有棱镜及光栅两种类型。（三）狭缝（三）狭缝:一对隔板在光路上形成的缝隙，用来调节入射单色光一对隔板在光路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度的纯度和强度 第二节第二节 分光光度计的基本类型和组件分光光度计的基本类型和组件二、分光光度计的基本组件二、分光光度计的基本组件（四
7、）比色杯（四）比色杯:玻璃比色杯用于可见光区，紫外光区要用石英比色杯。玻璃比色杯用于可见光区，紫外光区要用石英比色杯。标准光径为标准光径为10mm，还有带有自动进样装置的流动池。，还有带有自动进样装置的流动池。（五）检测及显示系统（五）检测及显示系统:光电检测器有四种类型：光电池、光电管，光电二极光电检测器有四种类型：光电池、光电管，光电二极管及光电二极管距阵。管及光电二极管距阵。第三节第三节 分光光度技术的应用分光光度技术的应用 一、定量分析一、定量分析 1标准曲线标准曲线(工作曲线工作曲线)法法 2.对比法对比法 =，即Cx=Cs 3计算法计算法 C=sAxALsKCLxKCsCxCsAx
8、AA第三节第三节 分光光度技术的应用分光光度技术的应用二、定性分析二、定性分析 用分光光度计绘制出样品的吸收光谱曲线。各种物用分光光度计绘制出样品的吸收光谱曲线。各种物质都有它自己一定的吸收光谱曲线，利用用吸收光谱质都有它自己一定的吸收光谱曲线，利用用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。曲线图可以进行物质种类的鉴定。一般情况，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个一般情况，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物质的结构，往往需要与红外、质谱等其它方法未知物质的结构，往往需要与红外、质谱等其它方法相配合。相配合。第四节第四节 测试条件的选择测试条件的选择一、测试波长的选择一、测试波长的选择 一般
9、都是选择吸收光一般都是选择吸收光谱图中最高峰谱图中最高峰的的max作为作为测试波长。这不仅能获测试波长。这不仅能获得高的灵敏度；而且由得高的灵敏度；而且由于在于在max附近吸光度随波附近吸光度随波长的变化较小，入射光长的变化较小，入射光波长的稍许偏移和非单波长的稍许偏移和非单色性引起的吸光度变化色性引起的吸光度变化较小，从而对比耳定律较小，从而对比耳定律的偏离较小的偏离较小 图1-4 测试波长的选择及影响测试波长的选择及影响测试波长的选择及影响 第四节第四节 测试条件的选择测试条件的选择二、测量狭缝的选择二、测量狭缝的选择 测定狭缝越窄，单色光测定狭缝越窄，单色光“越纯越纯”，分辨率越高，但入
10、射光强度，分辨率越高，但入射光强度也随之变弱，仪器噪声增大，于测量不利。也随之变弱，仪器噪声增大，于测量不利。狭缝过宽，单色光的带宽加大，纯度降低，将导致测量灵敏度狭缝过宽，单色光的带宽加大，纯度降低，将导致测量灵敏度的下降和工作曲线线性关系的变差。的下降和工作曲线线性关系的变差。狭缝的选择必须根据实际情况兼顾两方面的因素，选择一个狭缝的选择必须根据实际情况兼顾两方面的因素，选择一个适中的值。适中的值。三、吸光度测量范围的控制三、吸光度测量范围的控制 在在T2065(A0.70.2)的范围内误差相对较小，的范围内误差相对较小，当当T36.8(A0.434)时，测量的误差最小。时，测量的误差最小
11、。为避免较大误差的出现，在测量高浓度样品时必须将样品进为避免较大误差的出现，在测量高浓度样品时必须将样品进行适当的稀释行适当的稀释。第四节第四节 测试条件的选择测试条件的选择 四、参比溶液的选择四、参比溶液的选择 常用的空白溶液有以下两种。常用的空白溶液有以下两种。1溶剂空白：溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水如蒸馏水)作参比溶液。作参比溶液。2试剂空白试剂空白 当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可显色剂或其它试剂
12、在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的用不加入样品的“试剂空白试剂空白”作参比溶液，这作参比溶液，这种方式最为常用。种方式最为常用。第五节第五节 分光光度法的误差分光光度法的误差 一、物理性原因产生的误差一、物理性原因产生的误差 1.入射光的纯度入射光的纯度 2.杂散光的干扰杂散光的干扰 3.适当的吸光度测定范围适当的吸光度测定范围 二、化学性原因引起的误差二、化学性原因引起的误差 溶液的浓度、溶液的浓度、pH、溶剂、温度等对化学平衡所产生、溶剂、温度等对化学平衡所产生的影响。由于样品的离解、缔合、与溶剂间产生作用、的影响。由于样品的离解、缔合、与溶剂间产生作用、形成络合物等原因，导致溶液的各
13、组分间的比例发生形成络合物等原因，导致溶液的各组分间的比例发生变化。变化。第六节第六节 常见的分光光度计常见的分光光度计一、一、721型分光光度计型分光光度计 是一种采用棱镜为单色器、光电管为受光器、表头是一种采用棱镜为单色器、光电管为受光器、表头指示结果的常用的可见光分光光度计。其波长范围为指示结果的常用的可见光分光光度计。其波长范围为360800nm，在，在410710nm之间的灵敏度较好之间的灵敏度较好。第六节第六节 常见分光光度计常见分光光度计二、二、722S型分光光度计型分光光度计 这是一种数码显示的可见光分光光度计，采这是一种数码显示的可见光分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素
14、灯作光源，使用用衍射光栅作为单色器，卤素灯作光源，使用波长范围为波长范围为3401000nm。除了可直接进行透。除了可直接进行透光率光率T%和吸光度和吸光度A的测定，还具有浓度因子的测定，还具有浓度因子设定和浓度直读的功能设定和浓度直读的功能。第六节第六节 常见分光光度计常见分光光度计三、日本岛津三、日本岛津1240紫外紫外/可见分光光度计可见分光光度计（带（带Sipper 160型自动流动池）型自动流动池）这是一种微机控制、数码显示的紫外这是一种微机控制、数码显示的紫外/可见可见光分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，光分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯和氘（卤素灯和氘（D2）灯作光源
15、，使用波长范围）灯作光源，使用波长范围为为1901100nm。除了可直接进行吸光度。除了可直接进行吸光度A的的测定，还具有波长扫描和定量测定的功能。测定，还具有波长扫描和定量测定的功能。第六节第六节 常见分光光度计常见分光光度计四、日本岛津四、日本岛津1601紫外紫外/可见分光光度计可见分光光度计（带（带Sipper 160型自动流动池）型自动流动池）这是一种微机控制、数码显示的紫外这是一种微机控制、数码显示的紫外/可见可见光双光路分光光度计，采用衍射光栅作为单色光双光路分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯和氘（器，卤素灯和氘（D2）灯作光源，使用波长范）灯作光源，使用波长范围为围为19
16、01100nm。除了具有进行吸光度。除了具有进行吸光度A的测的测定和定量测定的功能外，还具有较强的波长扫定和定量测定的功能外，还具有较强的波长扫描功能。描功能。第六节第六节 常见分光光度计常见分光光度计四、日本日立四、日本日立U2000紫外紫外/可见分光光度计可见分光光度计 这是一种微机控制、数码显示的紫外这是一种微机控制、数码显示的紫外/可见可见光双光路分光光度计，采用衍射光栅作为单色光双光路分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯和氘（器，卤素灯和氘（D2）灯作光源，使用波长范）灯作光源，使用波长范围为围为1901100nm。除了具有进行吸光度。除了具有进行吸光度A的测的测定和定量测定的
17、功能外，还具有较强的波长扫定和定量测定的功能外，还具有较强的波长扫描功能。描功能。五五、使用分光光度计的注意事项、使用分光光度计的注意事项 1.分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。2.开机预热开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定期进行波长校准。定。每年需定期进行波长校准。3.必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来必须保证测
18、试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过离心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。离心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。4.从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。读数持续漂移上升。5.比色杯盛液量以达到杯容积比色杯盛液量以达到杯容积2/3左右为宜。比色杯左右为宜。比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布的外表面，则必须先用滤纸吸干，再
19、用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。6.不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光学面。用完比色杯后应立即用自来水冲擦比色杯的光学面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，也可用甲醇冲洗。洗涤后应把洗，再用蒸馏水洗净，也可用甲醇冲洗。洗涤后应把比色杯倒置晾干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻比色杯倒置晾干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。轻揩干。7.一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。8.一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.20.7的的范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调节样品溶液浓度，适当稀释光度不在此范围内，可调节样品溶液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。结结 束束
