1、原核生物基因表达调控原核生物基因表达调控生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室李长燕李长燕Tel:66930293email:生物大分子是生命的基础生物大分子是生命的基础分子生物学与诺贝尔奖分子生物学与诺贝尔奖 2010年，英国科学家罗伯特年，英国科学家罗伯特爱德华兹。他创立了体外受精技术，因此爱德华兹。他创立了体外受精技术，因此又被誉为又被誉为“试管婴儿之父试管婴儿之父”。2009年，伊丽莎白年，伊丽莎白布莱克本、卡萝尔布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克格雷德和杰克绍斯塔克。他们绍斯塔克。他们发现了端粒和端粒酶是如何保护染色体的，这一发现解决染色体在细发现了端粒和端粒酶是如何保护染色
2、体的，这一发现解决染色体在细胞分裂过程中是怎样实现完全复制的，同时还能受到保护不至于发生胞分裂过程中是怎样实现完全复制的，同时还能受到保护不至于发生降解。降解。2008年，德国科学家哈拉尔德年，德国科学家哈拉尔德楚尔楚尔豪森及法国科学家弗朗索瓦丝豪森及法国科学家弗朗索瓦丝巴巴尔西诺西和吕克尔西诺西和吕克蒙塔尼。豪森发现了人乳头状瘤病毒（蒙塔尼。豪森发现了人乳头状瘤病毒（HPV），巴），巴尔西诺西和蒙塔尼的获奖成就则是发现了艾滋病病毒（尔西诺西和蒙塔尼的获奖成就则是发现了艾滋病病毒（HIV）。）。2007年，美国科学家马里奥年，美国科学家马里奥卡佩基、奥利弗卡佩基、奥利弗史密斯和英国科学家马史密
3、斯和英国科学家马丁丁埃文斯。他们的一系列突破性发现为埃文斯。他们的一系列突破性发现为“基因靶向基因靶向”技术的发展奠定技术的发展奠定了基础，使深入研究单个基因在动物体内的功能并提供相关药物试验了基础，使深入研究单个基因在动物体内的功能并提供相关药物试验的动物模型成为可能。的动物模型成为可能。2006年，美国科学家安德鲁年，美国科学家安德鲁法尔和克雷格法尔和克雷格梅洛。他们发现了核糖核梅洛。他们发现了核糖核酸（酸（RNAi）干扰机制，这一机制已被广泛用作研究基因功能的一种手）干扰机制，这一机制已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新方法段，并有望在未来帮助科学
4、家开发出治疗疾病的新方法中心法则（中心法则（The central dogma）:基因表达基因表达-遗传信息流遗传信息流基因表达调控是个体发育的关键因素基因表达调控是个体发育的关键因素人类基因组计划人类基因组计划(Human Genome Project)(Human Genome Project)19861986年，美国学者提出了进行年，美国学者提出了进行HGPHGP研究的设想研究的设想19911991年，美国众院批准了一个年，美国众院批准了一个1515年的人类基因组研究年的人类基因组研究计划，总资助额为计划，总资助额为3030亿美元亿美元19941994年，我国启动了相关研究项目年，我国启
5、动了相关研究项目我国人类基因组南方小组、北方小组我国人类基因组南方小组、北方小组20002000年年6 6月月2626日，美、英、日、法、德和中国等六国日，美、英、日、法、德和中国等六国宣布，人类历史上最重要的科研工程宣布，人类历史上最重要的科研工程“人类基因组人类基因组”草图绘制成功草图绘制成功人类基因组分析的主要的内容人类基因组分析的主要的内容1.遗传图分析遗传图分析2.物理图分析物理图分析3.转录图分析转录图分析4.基因组序列测定基因组序列测定5.资料的储存和利用资料的储存和利用www.ncbi.nlm.nih.gov（一）后基因组时代研究内容（一）后基因组时代研究内容1.基因表达调控基
6、因表达调控2.功能基因组学功能基因组学3.人类蛋白质组学计划：组织器官：肝脏、人类蛋白质组学计划：组织器官：肝脏、血浆、脑；细胞；细胞器血浆、脑；细胞；细胞器（二）后基因组研究在医学发展中的意义（二）后基因组研究在医学发展中的意义 理论意义；应用价值理论意义；应用价值后基因组时代后基因组时代基因组基因组在个体水平代表个体所有遗传性状的总和；在个体水平代表个体所有遗传性状的总和；在细胞水平，是一个细胞所有染色体的总和；在细胞水平，是一个细胞所有染色体的总和；从分子角度认识，它代表了一个物种的所有从分子角度认识，它代表了一个物种的所有DNADNA分子的总和。分子的总和。基因组的结构与功能基因组的结
7、构与功能基因组中不同的区域具有不同的功能基因组中不同的区域具有不同的功能,有些有些是编码蛋白质的结构基因是编码蛋白质的结构基因,有些是复制及转有些是复制及转录的调控信号录的调控信号,有些区域的功能尚不清楚。有些区域的功能尚不清楚。不同的生物体，其基因组的大小和复杂程不同的生物体，其基因组的大小和复杂程度各不相同。度各不相同。不同生物体中不同生物体中DNADNA的大小的大小 基因表达调控的生物学意义基因表达调控的生物学意义 (一一)适应环境、维持生长和增殖适应环境、维持生长和增殖 生物体赖以生存的外环境是在不断变化的，为生物体赖以生存的外环境是在不断变化的，为了生存，所有活细胞都必须对外环境变化
8、作出适当了生存，所有活细胞都必须对外环境变化作出适当反应，调节代谢，以适应环境变化。生物体适应环反应，调节代谢，以适应环境变化。生物体适应环境、调节代谢的能力与蛋白质分子的生物学功能有境、调节代谢的能力与蛋白质分子的生物学功能有关。而蛋白质的水平又受基因表达的调控。关。而蛋白质的水平又受基因表达的调控。(二二)维持个体发育与分化维持个体发育与分化多细胞生物调节基因的表达除为适应环境外，还有维多细胞生物调节基因的表达除为适应环境外，还有维持组织器官分化、个体发育的功能。当某种基因缺陷持组织器官分化、个体发育的功能。当某种基因缺陷或表达异常时，则会出现相应组织或器官的发育异常。或表达异常时，则会出
9、现相应组织或器官的发育异常。原核生物是研究基因表达调控的模式生物原核生物是研究基因表达调控的模式生物原核生物是单细胞生物，在长期进化过程中演化出来的适应性和高度的应变能力，是它赖以生存繁衍的根本。细菌的生长与周围环境密切相关，它们必需不断调节各种不同的基因的表达以适应营养条件（如碳源、氮源）和对付周围不利的物理化学因素（如高温、射线、重金属、烷化剂）。迅速合成 迅速降解和停止 相适应 如噬菌体溶菌酶基因实用性高，成本低，供应量大转录转录RNA翻译翻译蛋白质蛋白质DNA RNA（病毒）（病毒）复制复制复制复制翻译翻译 蛋白质蛋白质（病毒）（病毒）逆转录逆转录中心法则（中心法则（The centr
10、al dogma）:DNADNA：脱氧核糖核酸：脱氧核糖核酸RNARNA：核糖核酸：核糖核酸生物遗传的物质基础生物遗传的物质基础 DNADNA的一级结构：碱基排列顺序的一级结构：碱基排列顺序 DNADNA二级结构：二级结构：DNADNA双螺旋双螺旋 Waston&Crick DNADNA的主要物化性质的主要物化性质 双螺旋的稳定性：双螺旋的稳定性：DNADNA的呼的呼吸作用吸作用 ；碱基组成碱基组成 ；盐；盐浓度；温度浓度；温度 DNADNA分子细长，其水溶液黏分子细长，其水溶液黏度高。度高。DNADNA分子易被机械力分子易被机械力或超声波剪切断裂。或超声波剪切断裂。核酸中的碱基在核酸中的碱基
11、在260nm260nm处具处具有最大光吸收有最大光吸收 DNADNA的纯度可以用的纯度可以用A A260260/A/A280280比比值来表示。纯值来表示。纯DNADNA的值为的值为1.81.8。DNADNA复制复制复制是从复制是从DNADNA分子上的特定位置开始的，这一位置分子上的特定位置开始的，这一位置叫复制原点，常用叫复制原点，常用oriori或或O O表示。许多生物的复制原表示。许多生物的复制原点都是双螺旋点都是双螺旋DNADNA呼吸作用强烈的区段，即经常开呼吸作用强烈的区段，即经常开放的区段，亦即富含放的区段，亦即富含ATAT的区段。的区段。DNADNA复制多数双向进行，也有一些单向
12、的，或以不复制多数双向进行，也有一些单向的，或以不对称的双向方式进行的。这是由复制原点的性质所对称的双向方式进行的。这是由复制原点的性质所决定的。决定的。DNADNA复制复制:半保留复制半保留复制 Waston&Crick Waston&Crick 最早提出的最早提出的DNADNA复制复制机理，在机理，在DNADNA复制过程中，两条螺旋复制过程中，两条螺旋的多核苷酸链之间的氢键断裂，然后的多核苷酸链之间的氢键断裂，然后以每条链各作为模板合成新的互补链。以每条链各作为模板合成新的互补链。这样新形成的两个子代这样新形成的两个子代DNADNA分子与原分子与原来来DNADNA分子的碱基顺序完全一样。在
13、分子的碱基顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条链来此过程中，每个子代分子的一条链来自亲代自亲代DNADNA。另一条链则是新合成的，。另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制这种复制方式称为半保留复制(semi(semi conservative replication)conservative replication)DNADNA复制的半不连续性复制的半不连续性 从一个复制叉上以不同的方向复制新生链，一条是连续的，另一条是不连续的，产生的片段为冈崎片段。不连续的合成需要模板上的特别序列或其它信号，借以周期性的起始合成冈崎片段，然后再将这些片段连接起来。就总体来说，两条新生链的合
14、成进度大体相同；但在复制叉处，连续合成的链总是领先于不连续合成的链，因此前者称为先导链，后者称为后随链。先导链先导链后随链DNADNA复制的酶学复制的酶学1.1.底物：底物：dATPdATP，dGTPdGTP，dCTPdCTP，dTTPdTTP，总称为总称为dNTPdNTP2.2.模板模板（templatetemplate）：解开成单链的）：解开成单链的DNADNA母链母链3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶:DNA pol:DNA pol4.4.引物引物（primerprimer）：）：RNARNA引物引物5.5.其他酶和蛋白质因子其他酶和蛋白质因子DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymera
15、se）DNA聚合酶以聚合酶以DNA为模板为模板,以以dNTP为原料为原料,需要镁离子作激动需要镁离子作激动剂催化如下的反应剂催化如下的反应:(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPiDNA聚合酶只能催化聚合酶只能催化dNTP加到已有核酸链的游离加到已有核酸链的游离3羟基上，羟基上，而不能使脱氧核糖核酸自身发生聚合，也就是说它需要引物而不能使脱氧核糖核酸自身发生聚合，也就是说它需要引物链的存在。加入的核苷酸由模板链决定。链的存在。加入的核苷酸由模板链决定。Mg2+细菌细菌DNADNA聚合酶聚合酶 分类分类 主要功能主要功能 Pol I 切除引物，及切除引物，及DNA修复修复 Pol I
16、I DNA修复：修复：3 3-5-5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 Pol III 主要复制酶主要复制酶 Pol IV 损伤旁路修复损伤旁路修复 Pol V 损伤旁路修复损伤旁路修复小片段小片段-35KD 大片段大片段68KD（Klenow fragment）5 3 聚合功能，聚合功能，3 5 外切酶活性外切酶活性5 3 外切酶活性外切酶活性DNA pol IDNA pol IEJPNMLHIORQGCDBFAK103KD103KD，一条单一多肽链，一条单一多肽链聚合作用聚合作用核酸外切酶：核酸外切酶：3 35 5：校对：校对功能；功能；5 53 3：切除引物：切除引物修复酶，参与局部修复修复酶
17、，参与局部修复蛋白水解酶：大片断蛋白水解酶：大片断（KlenowKlenow大片断），小片断大片断），小片断The model of DNA-pol III form the catalytic core Links two coresLeading strand synthesisLagging strand synthesis act as a clamp多亚基酶；大肠杆菌真正负责从新合成多亚基酶；大肠杆菌真正负责从新合成DNADNA的复制酶；的复制酶；3 3-5-5核酸外核酸外切酶活性；切酶活性；全酶由全酶由1010种亚基组成；核心酶：种亚基组成；核心酶：、三种亚基三种亚基大肠杆菌中大肠
18、杆菌中DNADNA聚合酶某些性质聚合酶某些性质 DNA-pol 性质性质 酶分子酶分子/细胞细胞 400 40 20活性（活性（nt/min）1000 50 1000005 3 聚合功能聚合功能 有有 有有 有有5 3 外切酶活性外切酶活性 有有 无无 无无3 5 外切酶活性外切酶活性 有有 有有 有有主要功能主要功能 校读校读,修复修复 修复修复 复制复制 填补缺口填补缺口引发酶引发酶(PrimasePrimase)5 5 DNA合成需在合成需在RNA引物引物的基础上进行。的基础上进行。RNA引物引物5 3 5 3 性质独特的RNA聚合酶，催化催化RNARNA引物引物合成合成E.coli的引
19、发酶一条单肽链，分子量为60KD,由dnaG基因编码。单独存在时不活泼，只有在与有关蛋白相互结合成为引发体时才有活性。与RNA聚合酶作用有所区别，不受利福平抑制拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerase,Topotopoisomerase,Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超螺旋负超螺旋负超螺旋正超螺旋正超螺旋DNA双螺旋双螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶在复制过程中，DNA的超螺旋结构必须解开，拓朴异构酶能松弛超螺旋。类型I:能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，蛋白，由topA编码，只能消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。类型II:使DNA的两条链同时发生断裂和再连
20、接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。Gyrase（旋转酶）E.coli中主要是DNA旋转酶，能产生负超螺旋并消除复制叉移动所产生的正超螺旋。香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等DNA旋转酶抑制剂均能抑制细菌DNA的合成。拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）解螺旋酶解螺旋酶 (helicase)(helicase)解螺旋酶解螺旋酶作用：作用：又称解旋酶，是促进又称解旋酶，是促进DNADNA的两条互补链分离的一类酶，具的两条互补链分离的一类酶，具有依赖有依赖DNADNA的的ATPaseATPase活性。其作用是在复制叉前解开一小段活性。其作用是在复制叉前解开一小段DNAD
21、NA。断裂互补碱基间的氢键，使断裂互补碱基间的氢键，使DNADNA成单链。成单链。ATPDnaA引发体（引发体（primosomeprimosome）：包括）：包括解螺旋酶解螺旋酶 、引引发酶发酶，RNARNA引物引物及及DNADNA复制的起始区域复制的起始区域5 3 3 5 引发酶引发酶DnaCDnaC引发体引发体解螺旋酶解螺旋酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single-strand DNA binding protein,SSB)SSB SSB对单链对单链DNADNA有高亲和力，能特异地结合到分开的有高亲和力，能特异地结合到分开的单链单链DNADNA上。对上。对DNADNA复制区形成的
22、单链复制区形成的单链DNADNA有稳定作用。有稳定作用。防止单链防止单链DNADNA重新形成双链重新形成双链,防止单链防止单链DNADNA被核酸酶水被核酸酶水解。解。DNA连接酶催化催化DNADNA双链的双链的3 3羟基羟基和相邻的和相邻的5 5磷酸基团磷酸基团形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键，从而把两段相邻的从而把两段相邻的DNADNA链连成完整的链链连成完整的链.这一反应需要这一反应需要ATPATP供能。供能。DNA DNA 连接酶不但在连接酶不但在DNADNA复制中起作用，而且在复制中起作用，而且在DNADNA损伤的修复和损伤的修复和重组重组DNADNA中不可缺少。中不可缺少。当切刻的当切刻
23、的3 3-OH-OH和和5 5-P-P相邻并各自的碱基处于配对状态时，相邻并各自的碱基处于配对状态时，DNADNA连接酶才能起作用。由于连接反应是在连接酶才能起作用。由于连接反应是在3 3-OH-OH和和5 5-P-P之间进行，之间进行，因此必须有因此必须有ATPATP或或NADNAD的水解来供应能量。在真核生物中使用的水解来供应能量。在真核生物中使用ATP,ATP,而在而在E.coliE.coli中连接酶使用中连接酶使用NAD.NAD.DNADNA连接酶连接酶NADNAD 参与参与DNADNA复制的主要成员复制的主要成员主要成员主要成员主要作用主要作用DnaA 识别复制起始位点识别复制起始位
24、点解螺旋酶解螺旋酶 解开解开DNA双链双链SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNA引物引物TOPO 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰松驰DNA-pol DNA复制复制DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接DNADNA复制的过程复制的过程1.1.复制的起始复制的起始 解链及复制叉的形成解链及复制叉的形成 引发体的形成引发体的形成2.2.链的延伸链的延伸 先导链和冈崎片段的形成先导链和冈崎片段的形成3.3.链的终止链的终止
25、引物的切除和缺口的填补引物的切除和缺口的填补 后随链后随链DNADNA片段的连接片段的连接 从新起始合成DNA发生在特定的DNA序列即复制原点之中，原核生物基因组一般只有一个复制原点，尽管有时主要复制原点因突变而丧失功能后会有次要的复制原点代替它；有RNA聚合酶所进行的转录激活是不可缺少的；不同的基因组还需要不同的蛋白质以识别其复制原点并形成引发体。ori C是E.coli DNA复制的起始位点，所有基因组DNA的复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状DNA也不是从末端开始复制的。DNA在复制原点处开始复制，总是先出现一个复制泡。复制的起始复制延伸复制延伸DNADNA聚合酶催化聚合酶催化3 3
26、-OH-OH不断发生不断发生DNADNA聚合作用聚合作用不需要不需要RNARNA引物引物前导链持续合成，后随链分段合成。前导链持续合成，后随链分段合成。复制的终止复制的终止环形环形DNADNA复制的终止：单向复制的环形分子复制的终止：单向复制的环形分子复制终点即复制原点；双向复制的环形分复制终点即复制原点；双向复制的环形分子两个复制叉向前推移，最后在终止区相遇子两个复制叉向前推移，最后在终止区相遇并停止复制。并停止复制。引物切除：引物切除：Pol IPol I的的5 5-3-3外切核酸酶活性外切核酸酶活性切口充填：切口充填：Pol I 5Pol I 5-3-3聚合酶活性聚合酶活性后随链片段的连
27、接：后随链片段的连接：DNADNA连接酶连接酶冈崎片段引物的消除和连接冈崎片段引物的消除和连接RNA引物引物RNA酶酶DNA pol IDNA连接酶连接酶DNADNA复制的一般特点复制的一般特点DNADNA的双螺旋的两条链在局部需要解开的双螺旋的两条链在局部需要解开,以利于每条链作以利于每条链作模板。模板。DNADNA聚合酶以聚合酶以55到到33方向合成。方向合成。DNADNA的两条链方向相反，的两条链方向相反，因此一条链的合成是连续的，而另一条链的合成则是不因此一条链的合成是连续的，而另一条链的合成则是不连续的。不连续链每个片段的合成都是独立进行的，然连续的。不连续链每个片段的合成都是独立进
28、行的，然后各片段再连接起来。后各片段再连接起来。DNADNA复制必须高度精确复制必须高度精确,DNA,DNA复制错误率大约是复制错误率大约是1/101/101010,校校正机制保证新合成的正机制保证新合成的DNADNA的正确性。的正确性。DNADNA的合成必须非常迅速的合成必须非常迅速,其合成速度与基因组的大小及其合成速度与基因组的大小及细胞分裂速度有关。细胞分裂速度有关。DNADNA半保留复制的意义半保留复制的意义DNADNA在代谢上的稳定性：经过许多代的复制，在代谢上的稳定性：经过许多代的复制，DNADNA的多核苷酸链仍可保持完整，并存在于后代而不的多核苷酸链仍可保持完整，并存在于后代而不
29、被分解。与其遗传功能相吻合。被分解。与其遗传功能相吻合。DNADNA在各种物理，化学和生物因子的作用下，会发在各种物理，化学和生物因子的作用下，会发生损伤、修饰、删除、扩增和重排。生损伤、修饰、删除、扩增和重排。进化的角度上看，进化的角度上看，DNADNA更是处在不断的变异和发展更是处在不断的变异和发展之中之中复制的调控复制的调控先导链合成的重新起始是染色体复制周期的开始，必然是处于严格控制之下的。参与这种控制的因素有两个方面：复制原点的特异性结构，另一方面是识别这种结构的特异性的蛋白质因子。转录激活是必须的，它不仅解开了复制原点的双螺旋，而且有利于引物的合成或直接提供引物，有时还转录了控制复
30、制起始的某些蛋白质因子的基因。复制原点除了含有特异的可为蛋白质因子识别的序列外，富含A/T序列是必不可少的。其原因可能是：富含A/T区段呼吸作用强烈，DNA易于解链；在富含A/T的序列中，容易产生RNA-DNA的合成转变。复制的调控复制的调控 复制起始的控制与质粒的拷贝数的控制是完全一致的。每个细胞中只有一个到两个拷贝的质粒称为严谨型质粒或低拷贝数质粒；每个细胞中有十个到一百个拷贝的质粒称为松弛性质粒或高拷贝数质粒。质粒的自私特性即不相容性也是与复制起始的控制密切相关的。具有相同或相似阻遏物的两种质粒常常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种
31、质粒的细胞相对减少。DNADNA复制的应用复制的应用PCRPCR技术技术（Polymerase Chain Reaction）PCRPCR原理原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR productPCR productSample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993for contributions to the developments of methods with
32、in DNA-based chemistry 1944-Kary B.Mullis for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)methodPCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primerprimer）酶酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase）dNTP dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板模板 （templatetemplate）MgMg2+2+（magnesiummagnesium）引物引物引物是引物是PCRPCR特异性反应
33、的关键特异性反应的关键PCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCRPCR就可将模板就可将模板DNADNA在体外大量扩增在体外大量扩增引物设计的原则（一）引物设计的原则（一）引物长度：引物长度：15-30bp15-30bp，常用为，常用为20mer20mer左右左右 引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 mer38 mer，否则最适延伸温度会，否则最适延伸温度会
34、超过超过TaqDNATaqDNA聚合酶的最适温度（聚合酶的最适温度（8080），不能保证），不能保证PCRPCR扩扩增产物的特异性增产物的特异性引物扩增跨度：以引物扩增跨度：以500bp500bp为宜为宜 特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10kb10kb的片段的片段引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜为宜 G+CG+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C G+C 过多易出现非特异条带过多易出现非特异条带 ATGCATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5 5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列成串排列引物设计的原则（
35、二）引物设计的原则（二）避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补，避免两条引物间互补，特别是特别是 3端的互补，否则会形成端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物引物 3端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致对而导致PCR失败失败引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处或分子
36、克隆很有好处引物设计的原则（三）引物设计的原则（三）引物的特异性：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性源性引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 1umol或或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会可增加引物之间形成二聚体的机会Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯
37、中分离纯化而得。该酶的分子量为化而得。该酶的分子量为63-68 kD 1.具有依赖于聚合酶活性的具有依赖于聚合酶活性的5 3外切酶活性外切酶活性 2.最适反应温度为最适反应温度为80 3.最适最适pH8.0和最佳反缓冲液和最佳反缓冲液TrisHCl 4.最佳二价阳离子最佳二价阳离子Mg2+（10 mM）5.具良好的热稳定性：在具良好的热稳定性：在90下连续反应下连续反应30分钟仍有分钟仍有70%的酶的酶活活 6.浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少模板（模板（TemplateTemplate）模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸
38、的量与纯化程度，是PCRPCR成败与否的关键成败与否的关键环节之一环节之一提取的核酸即可作为模板用于提取的核酸即可作为模板用于PCRPCR反应反应一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于因游离，直接用于PCRPCR扩增扩增单细胞单细胞PCRPCRMgMg2+2+浓度浓度 MgMg2+2+对对PCRPCR扩增的特异性和产量有显著的影响扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的在一般的 PCRPCR反应中，各种反应中，各种NTPNTP浓度为浓度为20
39、0umol/L200umol/L时，时，MgMg2+2+浓度为浓度为1.51.52.0 mmol/L2.0 mmol/L为宜为宜 MgMg2+2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，异扩增，浓度过低会降低浓度过低会降低 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的活性，使反应产物减少的活性，使反应产物减少dNTPdNTP dNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCRPCR扩增效率有密切关系扩增效率有密切关系 dNTPdNTP呈颗粒状，呈颗粒状，保存不当易变性失活保存不当易变性失活 dNTPdNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用
40、时应配成高浓度后，以1M NaOH1M NaOH或或1M Tris-HCl1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pHpH调节到调节到7.07.07.57.5，小量分装，小量分装，-20-20冰冻保存。冰冻保存。多次冻融会使多次冻融会使dNTPdNTP降解降解 在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/L200umol/L，尤其是注意尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ），），如其中任何一种浓如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错
41、配。浓度过低又会降低度过低又会降低PCRPCR产物的产量产物的产量 dNTP dNTP 能与能与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度降低浓度降低PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择 PCRPCR反应条件反应条件:温度温度时间时间循环次数循环次数温度与时间的设置：温度与时间的设置：设置设置变性变性-退火退火-延伸延伸三个温度点三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链标准反应中采用三温度点法，双链DNADNA在在90909595变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 40 6060，引物退火并结合，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至到靶序列上，然后快速升温
42、至70707575，在，在Taq Taq DNA DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100100300bp300bp时）可采用时）可采用二温度点法，二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般将退火与延伸温度合二为一，一般采用采用9494变性，变性，6565左右退火与延伸左右退火与延伸 变性温度与时间：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败的最主要失败的最主要原因原因 一般一般939394lmin94lmin足以使模板足以使模板DNADNA变性变性 若低于若低
43、于9393则需延长时间则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。影响。此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCRPCR产物完全变性，就产物完全变性，就会导致会导致PCRPCR失败失败 退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选
44、择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：TmTm值（解链温度）值（解链温度）=4=4（G+CG+C）2 2（A+TA+T）复性温度复性温度=Tm=Tm值值-（5 51010）在在TmTm值允许范围内，选择较高的复性温度可大值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCRPCR反应的特异性反应的特异性 复性时间一般为复性时间一般为303060sec60sec，足以使引物与模板之，足以使引物与模板之间完全结合间完全结合 延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引
45、物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数循环次数循环次数决定循环次数决定PCRPCR扩增程度扩增程度循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度选在选在30304040次之间次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多增多PCRPCR反应特点反应特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高简便、快速简便、快速对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低
46、TaqTaq酶热稳定性酶热稳定性：在：在PCRPCR循环中循环中DNADNA的变性时间常为的变性时间常为30-6030-60。Taq DNATaq DNA聚合聚合酶在酶在9090下保温下保温3030仍具有仍具有70%70%酶活性酶活性模板与引物的特异性模板与引物的特异性：合成产率合成产率：反应底物和产物在：反应底物和产物在DNADNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。延伸长度延伸长度：有时为了获取较长：有时为了获取较长DNADNA片段的扩增，这就要求片段
47、的扩增，这就要求DNADNA聚合酶具有较聚合酶具有较强的延伸能力。强的延伸能力。扩增产物的可靠性扩增产物的可靠性(保真性）保真性）：评估：评估DNADNA聚合酶的一个重要指标是它复制聚合酶的一个重要指标是它复制DNADNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCRPCR技术的可靠性是至关重要的。技术的可靠性是至关重要的。PCRPCR反应的影响因素反应的影响因素PCRPCR技术的应用技术的应用一、一、遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了AT的改变，从而导致该位点的
48、谷氨酸为缬氨酸所取代。的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代。AT突变还导致限制酶突变还导致限制酶OxaNI位点的消失。位点的消失。利用利用PCR技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下：技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下：DNA扩增扩增 PAGE 染色染色 观察观察 比较不同个体的结果比较不同个体的结果 限制酶切限制酶切 PAGE 染色染色 观察观察 此法可在此法可在3-4 h获得结果，比常规的获得结果，比常规的Southern杂交法简便、快速。杂交法简便、快速。PrimerOxaNIOxaNIOxaNIASOxaNI294191103扩增产物AA ASSS二、传染病的诊
49、断二、传染病的诊断 幽门螺杆菌的基因诊断幽门螺杆菌的基因诊断 梅毒螺旋体梅毒螺旋体 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 结核杆菌结核杆菌 SARSSARS 禽流感禽流感 HBV,HCV HBV,HCV HIVHIV常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个细胞中仅以很低的细胞中仅以很低的DNADNA拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而又特拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而又特异的异的HIVHIV检测方法检测方法.H1N1H1N1三、基因的快速克隆三、基因的快速克隆 根据已知基因序列设计根据已知基因序列设计PCRPCR引物引物,可直接
50、在不同的样品中可直接在不同的样品中进行进行PCRPCR扩增扩增,而不必分离纯化生物样品而不必分离纯化生物样品 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNAcDNA或基因组或基因组DNADNA为模板获得已知的目为模板获得已知的目的基因片段的基因片段 利用简并引物从利用简并引物从cDNAcDNA文库或基因组文库中获得具有一定同文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段源性的基因片段 利用随机引物从利用随机引物从cDNAcDNA文库或基因组文库中随机克隆基因文库或基因组文库中随机克隆基因四、基因突变四、基因突变 1 1）缺失突变）缺失突变 2 2）插入突变）插入突变 3 3）点突变）点突变-单点和多
