1、生命科学研究新进展系列讲座生命科学研究新进展系列讲座药物作用靶点与天然药物筛选药物作用靶点与天然药物筛选李海航李海航,Ph.D内容内容一.前言(我国药物行业存在的问题简介)二.药物靶,靶点或靶标三.药物靶标的发现四.基于靶标的药物设计五.靶点药物开发概况六.基于靶标的天然药物七.多靶点药物的开发八.重要疾病的靶点药物九.天然药物提取分离与靶点药物筛选研究我国药物研究与开发我国药物研究与开发生命科学各领域中最薄弱,最落后,面临危机西药：到目前为止只有开发了半个(青蒿素)或一个半自主药物中医药：最古老，也最落后缺乏系统的药物研究与开发体系急功近利,投机取巧,夸大吹嘘等成风,”研发”了大量无用新药,
2、无用新药批文中国工程院医药卫生学部院士秦伯益:“国家投入大幅度增长、新药苗头不断涌现,可成果寥寥无几,有国际影响的创新药一个都没有。”49年以来,我国自主研发、有国际影响的“新药”仅两个,50年代合成的二巯基丁二酸钠和60年代开发的青蒿素。60年代至今,无一原创药诞生。我国每年都有上百新药被注册,而美国、英国一年难出几例新药 中国工程院医药卫生学部院士秦伯益原创药原创药研发研发中存在三大误区中存在三大误区 误区一，对基因组药物学期盼过早。误区一，对基因组药物学期盼过早。盲目追求时髦的新概念盲目追求时髦的新概念2000年自然杂志对人类基因组研究现状与展望的评述 第一阶段:2000年测定全部DNA
3、序列；第二阶段:2010年识别所有基因；第三阶段:2050年确定所有基因功能；第四阶段:2100年确定基因变异与疾病关系”不少所谓专家学者“正根据基因变异设计药物”,短期内根本不可能.误区二，对中医药开发潜力指望太高。误区二，对中医药开发潜力指望太高。死守传统和古老的概念死守传统和古老的概念“中医药发展靠不断研究，而不是过头的舆论宣传”。“中华民族的繁衍生息靠的是中医药”、“西医治病、中医治本”、“西药有毒副作用，中药没有毒副作用”、“西医对疑难杂症没有办法，中医有办法”。过高指望中医不实际。“不少检查、治疗手段需要西医，中医不能相比。”误区三，传统的新药研发途径过时了。误区三，传统的新药研发
4、途径过时了。传统新药研发途径包括:经验积累、偶然机遇、药物普筛、综合筛选、天然物提取、定向合成、代谢与药理研究、毒副作用、老药新用等。现在新药研发的团队都想“一口气吃个胖娃娃”、“跨越发展”,不符合发展规律。很多研究人员都没有“蹲下去找靶点靶点调研。我国药物创新和我国药物创新和研发研发存在的问题存在的问题中和药业1研发经费不足。全国药物研发总投入少于美国的辉瑞公司。2技术水平有限,研发团队建设不力。药物行业是技术密集型行业。没有几个企业真正投入技术力量研发新药,无研发部门或研发部门转行。国外药企研发人员占从业员30%,我国不到4%,且大多从事技术型改造。3主流研发机构与药企合作不成熟。研究机构
5、重文章,企业重市场。4.宏观政策影响大,缺乏总体规划,高税收和逐年降价使企业濒临停产。5.知识产权问题日益突出。外国药企纷纷加大在中国的知识产权保护。在国外上市的新药中几乎不可能有新药供国内药企仿制。美国、日本、欧盟批准的新药在化合物专利、制备工艺专利、适应症专利、用法用量专利都获得相应的保护。我国药品我国药品市场市场现状及存在的问题现状及存在的问题 我国医药业年均增长17%,在36个行业中排第18-20位,总值占GDP的3.2%.1）制售假劣药行为屡禁不止。生产和销售假劣药的范围和规模不断扩大。2）药品虚假广告铺天盖地。夸大疗效被药企奉为营销宝典,违法率达95%。3）药品购销不规范,商业贿赂
6、严重,回扣风行。行贿受贿已是公开的秘密。药品在流通过程中价格翻十几倍,造成药价过高。研发好药不如搞定几家医院!4）无证经营和超范围经营,买卖、出租、出借许可证等屡禁不止。5）零售药店和生产企业不规范。80%以上购药者会向药店销售员咨询,大多数最后采纳其意见选药。但药店销售人员70%以上未经正规医药知识培训。销售员为“厂家提成”而向顾客推荐高价药。一些药企取得GMP等认证后,为节约成本和迅速获利而降低生产条件和管理。药物研究与开发是我国药物研究与开发是我国最有发展潜力的行业之一最有发展潜力的行业之一药物开发途径的变化药物开发途径的变化传统的药物筛选途径传统的药物筛选途径化合物化合物 组织组织,细
7、胞细胞,动物动物 分子分子(作用靶作用靶)人体人体现代药物筛选途径现代药物筛选途径分子分子(作用靶作用靶)化合物化合物 细胞细胞,组织组织,动物动物,人体人体靶点药物与靶向治疗靶点药物与靶向治疗手术靶向给药手术靶向给药:穿刺给药,手术局部给药,脏器动脉/血管给药,靶点靶点/标药物标药物(主动靶向主动靶向)靶向给药靶向给药(被动靶向被动靶向)局部给药局部给药:膏药,局部用散剂,眼膏,眼药水,宫内给药,栓剂,肠溶剂,长效缓释剂或前体药物长效缓释剂或前体药物:微球,微囊,脂质体,磁性微球,细胞载体,药物-大分子/配体/单克隆抗体结合物我国研究我国研究:脂质体,药物-糖蛋白/单克隆抗体结合物,蛋白质等
8、各种天然与合成物相结合物的微球,肝/脑靶向前体药等存在的问题存在的问题:工艺复杂,载药量少,稳定性差,制剂,体内代谢,评价与标准,体内生理作用等.大量生产尚有不少问题.药物与病变细胞特定部位或特定分子结合来实现药物的作用。大多是与特定细胞或蛋白有特异反应的分子或分子基团,如抗体、单抗、蛋白受体、激素类等。二二.药靶药靶 (Drug Targets)1 药靶的定义药靶的定义:存在于组织细胞内,与疾病发生有因果关系或参与疾病发展,与药物相互作用,并可通过药物对其进行调节而实现治疗目的治疗目的的特定生物分子2 药靶的条件药靶的条件:与疾病相关,有适当的化学特性和亲和力结合小分子物,在病变细胞或组织中
9、表达,在细胞培养体系中可通过调节靶标活性产生特定效应,在动物模型中再现,药物在人体内有效有效。3.药靶的化学成分药靶的化学成分:绝大多数(98%以上)为蛋白质蛋白质。50%以上属G蛋白耦联受体,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶蛋白激酶,锌金属肽酶,丝氨酸蛋白酶,核激素受体及磷酸二酯酶等6个家族。4.药靶的意义药靶的意义:药物发现从依赖动物筛选逐渐转变到“一病一靶”。是高通量高通量药物筛选及其模型建立的基础.5.最成的例最成的例:胆固醇合成抑制剂 HMG(3-羟基-3甲基戊二酸单酰)辅酶辅酶A还原酶还原酶为靶点的选择性抑制剂,已有系列他汀类降脂药物,全球销售量最大药,最有效降胆固醇药.三三.药靶的
10、发现药靶的发现 靶点的发现主要通过靶点的发现主要通过基因基因,蛋白质和药物蛋白质和药物三个方面三个方面.1.基因水平上的靶点发现基因水平上的靶点发现1)人类遗传学,生物信息学,表达图谱,代谢途径分析,基因芯片,mRNA差异显示,消减杂交等,结合表型变化发现大量候选靶标.(重要和关键基因重要和关键基因)2)宿主和病原菌或正常细胞与病理细胞之间的基因差异表达差异表达和基因序列序列分析,找出疾病相关基因.3)疾病相关基因(靶基因)功能分析功能分析,包括基因敲除,过量表达,RNA 干扰,反义mRNA 和核酶抑制及计算机模拟基因产物结构和功能分析,确认药物靶点.2.2.以蛋白质组学为基础发现药物靶标以蛋
11、白质组学为基础发现药物靶标人体内可能的药靶约300015000个,目前发现的不到500个,多数药靶是蛋白质,如酶、受体、激素。1)1)差异蛋白质差异蛋白质:差异蛋白组学法比较疾病和正常状态蛋白表达差异,找可能药靶.常用技术常用技术:蛋白质芯片,二维凝胶电泳,同位素亲和标签,双向荧光差异凝胶电泳等技术及它们和质谱鉴定的结合。应用较多的应用较多的:二维凝胶电泳和质谱分析二维凝胶电泳和质谱分析。急性淋巴细胞白血病中的高表达多肽Op18有磷酸化和非磷酸化两种形式,抑制Op18及其表达或磷酸化能有效抑制肿瘤细胞增殖,有望以Op18为靶开发药物。2)2)蛋白质相互作用蛋白质相互作用:蛋白质与蛋白质相互作用
12、。常用方法常用方法:有酵母双杂交,噬菌体展示,表面等离子共振,串联亲和纯化和双分子荧光互补等。酵母双杂交酵母双杂交是发现药靶的重要途径。通过报告基因表达产物可敏感地检测蛋白质之间相互作用路径及药物干扰阻止其相互作用以达到治疗疾病的目的。3.药物分子为探针发现药物靶标药物分子为探针发现药物靶标1)“药钓靶药钓靶”与与“靶钓药靶钓药”:生物分子相互作用分析生物分子相互作用分析。用药物单分子作为用药物单分子作为探针探针,跟踪监测它与蛋白质分子之间的相互作用来发现药靶。跟踪监测它与蛋白质分子之间的相互作用来发现药靶。配体垂钓:将药物分子探针固定在传感器芯片表面,将与之相互作用的分子(如配体蛋白质)溶液
13、流过芯片表面,检测溶液中分子与芯片表面分子结合和解离的整个过程,称作“配体垂钓”。亲和层析亲和层析:固定药物分子筛选靶点,或固定靶点来筛选药物分子。2)计算机模拟计算机模拟:以药物为探针以药物为探针,计算机模拟药物与蛋白质三维结构及其相计算机模拟药物与蛋白质三维结构及其相互作用互作用,找出能与其特定结合的蛋白或潜在药靶。找出能与其特定结合的蛋白或潜在药靶。3)药物作用前后基因和蛋白质表达的改变药物作用前后基因和蛋白质表达的改变,找出可能的药靶。找出可能的药靶。如:用基因芯片研究苦参碱诱导白血病K562细胞基因表达谱,发现CCNB1,cyclinD1,PCNA等基因表达显著改变,可能是苦参碱作用
14、靶点。四四.基于靶标的药物设计基于靶标的药物设计利用配体-靶标复合物三维结构信息设计新药,基本过程:确定药物作用靶标(如蛋白质、核酸等);对靶标进行分离纯化;确定靶标三维结构,提出系列假定配体与靶分子复合物的三维结构;依据这些结构信息,利用相关计算机程序进行配体分子设计,模拟出最佳配体结构模型;合成模拟结构物,测试活性。若满意可进入前临床实验.重复以上过程,直至满意为止.需要的条件需要的条件:X射线衍射和核磁共振(NMR)等结构研究手段,研究靶蛋白分子结构,计算机辅助的靶蛋白结构模型建立和药物设计。如治疗艾滋病艾滋病的安瑞那韦(amprenavir,Agenerase)和奈非那韦(nelfin
15、avir,viracept)就是用HIV蛋白酶的晶体结构开发的药物.药物研发需要生物学药物研发需要生物学,化学化学,电脑电脑物理物理,仪器分析等多个领域合作仪器分析等多个领域合作五五.靶点药物开发概况靶点药物开发概况现代药物开发是基于特定靶寻找先导化合物靶寻找先导化合物,进而筛选候选药物的过程。人类基因组研究人类基因组研究结果预测:有600种小分子靶点,1800多蛋白质靶点,及2100种基因治疗和siRNA治疗靶点。失败教训失败教训:近20年对高选择性靶点高选择性靶点的集中研发,候选新药经临床试验后成功上市的比例不但没有增加，反而不断下降。新靶标药物研发的失败率不断增加。对药物研发思路产生了极
16、大的挑战.FDA 1989-2000 FDA 1989-2000 年年批准的361个新分子实体药物,仅6%是基于新药物靶点。因此,制药公司纷纷调整研发模式:新靶标药物研发,已有靶标药物研发,me-too类改良药物以及部分生物仿制药研发等。经典经典“可药性可药性”靶点：靶点：酶、G-蛋白偶联受体和核激素受体等。这些靶点的药理机制较明确,开发经验较成熟,成功率高。有开发潜力的靶有开发潜力的靶:同源序列少(不超过5个),参与的调节路径少(不超过2个),分布的主要组织少(不超过2个),靶标的开发潜力/前景较好。1.1.上市药物的靶标数量上市药物的靶标数量Drews等(1997)粗略推定为483个分子药
17、物靶标。Hopkins 和 Groom(2002)根据药物起效的5条原则,目前药物仅通过120个靶标起主要作用。Golden(2003):所有上市药物对应了273种蛋白。Imming(2006)等对药物靶标作了明确界定,认为药物靶标是一种能够与化学试剂特异结合并产生临床疗效的分子结构。不包括药理学和生物化学研究工具以及相关技术。得出的结论：目前的分子药物靶点数目为218个。Overington 等等(2006)提出有价值的评估提出有价值的评估:药物数量减至1357种。所有药物通过324个靶标起作用,其中266个为人类基因衍生的,其余为病原体靶标。小分子药物作用于248种蛋白,其中207个靶标由
18、人体基因组编码;口服小分子药物靶标227个,其中186个为人类基因靶标。Overington JP,Al-Lazikan IB,Hopkinsal.How many drug targets are there?Nat Rev Drug Discov,2006,5(12):993-996.2.上市药物靶点的类别上市药物靶点的类别生物化学分类生物化学分类:上市小分子和生化药靶点,50%以上属4 个关键生化类别:G-蛋白偶联受体(26.8%),核受体(13%),配体门控性离子通道(7.9%)及电压门控离子通道(5.5%)。其他包括青霉素结合蛋白,髓过氧化酶,神经递质,DNA拓扑异构酶,纤维结合蛋白
19、,细胞色素P450等。生物结构位点生物结构位点:细胞膜表面(60%),细胞质(16%),细胞核(10%),胞外分泌(8%),线粒体(3%),内质网(2%),过氧化酶体(1%)。约1/3的靶点是膜本身疾病领域分布疾病领域分布:268个上市药物靶点,依次是肿瘤,传染病和寄生虫病,神经系统,感觉器官病及循环系统疾病等。这些疾病都有代表性靶点药物化学分类化学分类:肿瘤和抗感染领域的主要药物靶点是酶酶。中枢神经系统和循环系统疾病通常靶向G-蛋白偶联受体、离子通道或载体等。不同化学特征药物所靶向的靶点不同化学特征药物所靶向的靶点:合成药物合成药物通常靶向G-蛋白偶联受体、酶、离子通道和载体等。天然产物天然
20、产物主要靶向N-末端重复序列,而生物制生物制品品(抗体或重组制剂)主要靶向其他膜受体。Distribution of Targets by Biochemical Criteria Distribution of Targets in Therapeutic Areas 六六.多靶点药物多靶点药物 多靶点药物定义多靶点药物定义:同时作用于某一疾病相关或病原体的多个分子靶,具有多种药理活性。比单靶药物的疗效显著、作用全面、副作用少。原因原因:疾病起因多因素性疾病起因多因素性:单一靶基因异常引起的疾病只占少数,多数疾病由多基因或多靶点引起,如心血管病,肿瘤及神经退行性疾病等,糖尿病等.信号传导途径
21、的多样化信号传导途径的多样化:如癌症等,有多条信号传递途径,并有互通性。平衡机制与旁路系统平衡机制与旁路系统:1)同一靶作用多样,过分抑制导致严重毒副作用；2)代谢，信号或调控途径多样性,抑制一条途径会激活另外的途径/旁路;3)疾病的适应/耐药性,如病毒的突变等.理论基础理论基础:按照拓扑网络模型理论按照拓扑网络模型理论:一个系统中对35 个因素(相当于药靶)的部分抑制可以达到对单一最重要因素的完全抑制。疾病网络系统研究疾病网络系统研究:单独对某一靶点调节,在复杂疾病治疗中有局限性。多靶点药物可同时作用于疾病网络中多个靶点,对各靶点产生协同效应,使总效应总效应大于各单效应之和大于各单效应之和,
22、达到最佳治疗效果.多靶点药物的分类及作用方式多靶点药物的分类及作用方式按药物组分不同分三种形式按药物组分不同分三种形式:1）多种药联合用药）多种药联合用药(Multidrug combination):最为常见,为抗艾滋病和肿瘤主要策略。缺点是所含药物彼此易发生相互作用而产生不良反应.2）多组分药物多组分药物(Multicomponent drug):药剂中含多种活性组分,效果较好的联合用药被制成多组分药,如抗艾滋病药Atripla,抗哮喘药Advair 和丙肝药Rebetron。3）单组分药同时选择性作用于多个靶点单组分药同时选择性作用于多个靶点:即严格意义上的多靶点药物(multitarg
23、et drug).优化一个多靶点药使之同时产生多靶点选择性而不是非选择性难度很大.按靶间关系的作用方式分三类按靶间关系的作用方式分三类:影响不同靶而产生组合作用影响不同靶而产生组合作用:各靶存在于特定组织、细胞或细胞间液中的相同或不同部位,代谢或信号通路;药物对第一个靶点的作用可对第二个靶点产生影响药物对第一个靶点的作用可对第二个靶点产生影响:如改变药物代谢、抑制外排泵或阻断其他抗性机制;作用于某一靶分子或分子复合物上的不同位点作用于某一靶分子或分子复合物上的不同位点发挥联合作用进而增强药理活性.多靶点药物的发现策略和筛选模型多靶点药物的发现策略和筛选模型高通量靶点筛选使用非细胞体系,不能模拟
24、完整细胞的生物学特性,因此不能用于多靶点药物筛选。1)基于细胞表型分析基于细胞表型分析:单细胞水平单细胞水平:高效性,含有疾病相关的代谢或信号通路,增加了潜在协同作用的发现,广泛用于多靶点药物研究。多细胞联合培养体系多细胞联合培养体系:组织,器官 或多种不同类型的细胞.如混合培养的淋巴细胞筛选抗炎药。模式生物模式生物:整体的生物体内筛选.2)综合性作用的联合筛选综合性作用的联合筛选:联合用药时,一种组份诱导对另一种组份的敏感性.3)配伍配伍(比例比例)分析分析:比较联合用药和组分单独用药时活性差别,优化各组分用量。如连续稀释某一组分的配伍比例进行剂量-效应分析,找出协同效应.多靶点药物设计多靶
25、点药物设计 主要策略主要策略:平衡药物对多个靶点之间的效应。1)连接配体连接配体:用接头将独立的药效基团连接起来.但产生的多靶点分子往往较大,很难口服给药和吸收。2)重叠配体重叠配体:各药效团间重叠或高度整合,产生的分子量较小。如:基于血管紧张素1受体的配体和内皮素A受体的配体所共有的联芳核所设计的重叠配体有更好的抗高血压活性。3)改善疾病耐药性改善疾病耐药性:艾滋病靶点逆转录酶的一个氨基酸突变就可产生耐药性.设计可对野生型和耐药性突变体逆转录酶均有抑制作用的化合物。七七.基于分子靶点的天然药物开发基于分子靶点的天然药物开发 优势优势:1)选材多样性选材多样性是新药筛选关键,植物含天然物种类多
26、是实验室无法完成的。2)中医强调整体性和协调性,中药活性组分作用于多靶点多靶点共同发挥疗效,属多靶点药物治疗。3)中药复方中药复方原料和成分复杂,用于多个靶点时比合成药物有天然优势。4)有些中药单体中药单体通过多靶点起作用作用。如姜黄素姜黄素有强抗肿瘤活性和高安全性,为最受关注的多靶点药之一。它可影响多条信号转导通路而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和血管新生,临床药效评价进行中.问题问题:1)与合成药比,中药作用机制更复杂,寻找中药靶点进展困难。传统的板蓝根的作用靶点至今没找到。2)有专家认为,很多植物药找不到靶点,可是作用于小分子无机盐而被忽视.小分子靶点研究技术少,但可能给开发植物药类靶点药
27、物打开一扇大门。八八.重要疾病的靶点药物重要疾病的靶点药物靶点药物应用最多的是肿瘤。其次是艾滋病靶点药物应用最多的是肿瘤。其次是艾滋病HIV,HIV,阿尔茨阿尔茨海默病海默病(Alzheimer),(Alzheimer),肝炎肝炎,前列腺增生及糖尿病前列腺增生及糖尿病等.问题问题:抗癌药多直接攻击DNA或其合成,对肿瘤细胞缺乏特异性.针对特异靶标分子研制特异性药物特异靶标分子研制特异性药物是今后研发的方向。1.肿瘤分子靶向药物肿瘤分子靶向药物1997 年美国FDA 批准首个单抗药物利妥昔单抗用于NHL.已有近20种分子靶向药物上市,在研药物100 余种。大致分以下几类:1)大分子单克隆抗体大分
28、子单克隆抗体.如:表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤增殖,生长,浸润,转移等关系密切。2)小分子化合物小分子化合物.靶点为代谢关键酶或酪氨酸激酶。3)多靶点作用药物。多靶点作用药物。索拉非尼(05年上市):口服小分子双通道多激酶抑制剂小分子双通道多激酶抑制剂,靶向肿瘤细胞及血管上的酪氨酸激酶。拉帕替尼(07年上市):口服小分子酪氨酸激酶抑制剂,对EGFR双重抑制。重要的肿瘤药物靶点重要的肿瘤药物靶点1.信号传导信号传导:如酪氨酸激酶.打仗时不打邮递员2.肿瘤生长因子肿瘤生长因子:如表皮和血管内皮生长因子及其受体.3.代谢酶类代谢酶类:如核酸代谢,激素代谢,能量代谢等相关
29、酶.1)核酸代谢相关酶类核酸代谢相关酶类.复制与(逆)转录及核苷酸代谢等酶.拓朴异构酶拓朴异构酶(DNA topoisomerase I):参与DNA 复制。其抑制剂阻止复制和链重新组装,引起DNA 双链断裂,肿瘤细胞死亡。靶点药有喜树碱、羟基喜树碱喜树碱、羟基喜树碱、依立替康、拓扑替康、贝洛替康等。核糖核苷酸还原酶核糖核苷酸还原酶:四种NDP还原成dNDP,DNA合成与修复,双缩尿.腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶:维持腺苷水平,抗白血病,提高腺苷类药物作用.2)激素代谢酶类激素代谢酶类.芳香氨酶芳香氨酶(Aromatase):细胞色素P450与黄素蛋白组成的膜结合复合酶,为雄激素合成所必须的,也催化雄
30、激素向雌激素转化,是雌激素合成限速酶。乳癌治疗的两种主要选择:(1)雌激素及其受体拮抗剂;(2)抑制芳香氨酶活性而切断雌激素合成。乳腺癌的治疗乳腺癌的治疗1.针对激素内分泌治疗针对激素内分泌治疗:绝大多数乳腺癌是激素依赖性肿瘤。绝大多数乳腺癌是激素依赖性肿瘤。1).抗雌激素类:三苯氧胺(竞争结合雌激素受体受体),氟维司群(阻滞雌激素受体).2).芳香化酶抑制剂:抑制雄激素向雌激素转化转化,如CYP19已成功应用.3).孕激素类孕激素类(多靶点):抑制促黄体生成素和雌激素产生产生;与孕激素受体受体竞争结合4).促性腺激素释放激素类似物激素类似物:减少雌激素产生,常用药有goserelin等。2.
31、针对癌相关基因及其产物的靶分子治疗针对癌相关基因及其产物的靶分子治疗1)肿瘤生长因子及其受体靶向:生长因子及受体的单抗和酪氨酸激酶抑制剂 2)肿瘤血管生成分子靶向:Avastin单抗,抑血管生成的Endostar和Thalidomide3.其它靶分子治疗其它靶分子治疗:法尼基转移酶抑制剂阻断Ras介导的信号转导信号转导多靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂酪氨酸激酶抑制剂sunitinib抑制磷酸肌醇-3-激酶和癌细胞生长细胞生长的雷帕霉素胰岛素样生长因子生长因子-1(IGF-1)及其受体或磷酸化的拮抗和抑制剂拮抗和抑制剂凋亡凋亡抑制物的抑制剂与肿瘤侵袭肿瘤侵袭有关的磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸酶PKC-
32、抑制剂良性前列腺增生良性前列腺增生(BPH)药物作用靶点药物作用靶点老年男性常见病临床药物主要针对临床药物主要针对2个较成熟靶点个较成熟靶点:1)5-还原酶还原酶:前列腺是雄激素依赖器官,雄激素代谢异常可导致BPH。作用最强的雄激素二氢睾酮由该酶催化而成。该酶为治疗BPH 的关键靶点.已有数种酶抑制剂用于BPH治疗。2)肾上腺素受体肾上腺素受体:前列腺增生引起膀胱出口梗阻,导致膀胱甚至肾功能损害。其治疗原则是先尽快减轻或解除梗阻,保护膀胱和肾功能。其抑制剂为治疗BPH及下尿路症首选药。新靶点新靶点:1).磷酸二酯酶磷酸二酯酶5:特异性裂解胞内第二信使cGMP。最初是治疗心绞痛心绞痛和高血压高血
33、压的靶点药,其抑制剂后来成为治疗男性功能障碍男性功能障碍一线药;也能治疗前列腺增生伴下尿路症状前列腺增生伴下尿路症状。如西地那菲Viagra。2).糖酵解酶糖酵解酶:前列腺能量代谢很独特,其上皮中积聚大量柠檬酸和锌,高浓度锌抑制/阻断三羧酸循环。只能依赖于糖酵解获取能量。糖酵解酶抑制剂可治疗BPH。3).芳香化酶芳香化酶:雌激素在前列腺增生发生和发展中起重要作用。男性体内雌激素主要由雄激素转化来,芳香化酶P450 是其关键和限速酶。其抑制剂有治疗良性前列腺增生等激素依赖疾病。4).生长因子生长因子:一些肽类生长因子与前列腺增生有关。其抑制剂可治疗BPH。5).内皮素内皮素:强烈平滑肌收缩因子,
34、可使前列腺平滑肌收缩,参与梗阻。其受体拮抗剂改善尿道梗阻2.艾滋病艾滋病HIV1).免疫预防和治疗免疫预防和治疗:医学史上,天花等传染病的消灭依靠疫苗,而不是抗病毒药物。人们期待有效的抗HIV疫苗的诞生,但目前尚未取得突破性进展.2).HIV-1 化疗治疗：化疗治疗：抗逆转录逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy,ART)是医学史上发展最快的治疗方法。96 年前称“艾滋病鸡尾酒艾滋病鸡尾酒”(AIDS cocktails)。96 年世界艾滋病会议决定用HAART(highly active anti-retroviral therapy)代替,它使AIDS 死亡率大大下降
35、HAART指3 种或以上种或以上HIV 病毒酶抑制剂联合应用,常用1 种蛋白酶抑制剂与2 种核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)联合使用,或用1 种非核苷类的逆转录酶抑制剂(NNRTI)与2 种NRTI 联合使用。但HAART 易产生抗药性抗药性,对潜伏病毒潜伏病毒不起作用等问题。3).抗药性抗药性.HIV非常容易产生抗药性。其逆转录酶的“不忠实性”和缺乏“校正机制”,使每个基因组在1个复制周期就产生1个突变。突变突变是抗药性产生的遗传基础。完全抑制病毒复制可使抗药性产生的机会大大减少。不恰当治疗,特别是部分抑制病毒,给病毒抗药性形成提供选择压力,加速抗药性的形成。中药对药物副作用的舒缓可增加用药
36、的持久性和药物对病毒的抑制度,可望有助于解决抗药性问题。此外,期待中药成分的多样性能产生多靶点作用。4).HIV的潜伏是彻底清除的潜伏是彻底清除HIV的最大障碍的最大障碍“潜伏潜伏”(latency):病毒以可逆的非复制状态存在宿主体内,在宿主内长期存在.HIV 感染者即使在长期无症状期,血浆中RNA拷贝都维持在104-105个/ml。低水平复制使病毒演变,形成新的免疫逃脱和抗药株.HIV 潜伏库衰减速度非常慢,1/2清除需44个月,清除含106的潜伏细胞库要花费73年。HAART可使血浆病毒降到50个/ml拷贝以下,并维持达6-7年,而潜伏库丝毫没有清除迹象。有患者治疗后,血浆病毒降到50个
37、/ml RNA 拷贝以下长达3 年,但一旦停药,几星期内血浆病毒立即回升到治疗前水平.HIV与其他病毒不同之处与其他病毒不同之处:1)逆转录病毒;2)感染的靶细胞为CD4+HTL,3)潜伏细胞频率太低,缺乏分离技术。目前没有直接针对潜伏HIV 的药物。当前的策略当前的策略是激活有潜伏HIV 的休止细胞,把它们从潜伏库里“冲洗”出来。从南太平洋萨摩亚岛植物中分离出的佛波醇酯(phorbol ester)的物质prostratin,在体内能诱导休止的CD4+HTL 表达潜伏HIV,且不激发细胞增殖。待解决的问题待解决的问题:HIV潜伏记忆藏在那里?有什么标记性特征?能否把它们分离?能否证明细胞的基
38、因组里存在HIV原病毒DNA?能否激活原病毒使它成为能感染活化的CD4+HTL?能否在体外或小动物建立HIV 潜伏模型?HIV 研究受条件的局限性较大。研究受条件的局限性较大。(1)三个病毒催化酶三个病毒催化酶.逆转录酶,整合酶和蛋白酶,为较理想的靶点。逆转录酶逆转录酶:把病毒单链RNA变成原病毒双链DNA,为主要的药物靶点。核苷类(NRTI)与酶竞争而抑制酶活;非核苷类NNRTI与酶结合使其变构而失活。以它为靶点的药物最多,高效新药不断出现。整合酶整合酶:把原病毒双链DNA 整合到宿主基因组中,为抑制病毒复制和阻止病毒潜伏的理想药靶,因种种原因此类药物目前还没有上市此类药物目前还没有上市。蛋
39、白酶蛋白酶:把长多肽链切成较小片段,成为有功能的成熟核蛋白,蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性,也抑制了病毒的成熟。(2)阻止融合的蛋白质阻止融合的蛋白质.与抑制复制比,阻止与宿主融合,从而阻止病毒进入细胞,似乎更加“棋高一着”。病毒与宿主细胞融合抑制剂一直是抗艾滋药物研究的重点。与病毒蛋白结合与病毒蛋白结合,阻止融合阻止融合.临床上与抗逆转录药物联合用于对其他药物无效患者。与宿主蛋白结合与宿主蛋白结合,阻断融合阻断融合.细胞表面分子CD4及趋化因子受体CCR5和CXCR4是HIV进入靶细胞的受体分子。针对这些分子的单克隆抗体及小分子物可能成为新药。5).HIV-1 感染药物研发的新靶点感染药物研发的
40、新靶点.抗HIV药物研发不仅促进了药物研发和研发速度,还改变了从药物到药靶的传统研发模式,发展了从药靶到药物的现代研发模式:根据HIV分子资料,确定逆转录酶、蛋白酶逆转录酶、蛋白酶等为药靶,基因工程表达药靶蛋白,X线衍射等绘制晶体图像,计算机分子建模,候选药物设计和修饰,最后进行药理,药物,临床前及临床研究。3.阿尔茨海默病阿尔茨海默病阿尔茨海默病阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD):老年痴呆中首病之一,以认知障碍和记忆力认知障碍和记忆力损害损害为特征的慢性中枢神经系统退行慢性中枢神经系统退行性疾病。发病机制复杂,病因未完全阐明发病率发病率:65岁以上约10%,85岁以上
41、约47%。全球2600万,我国700万;无阻止,延缓或防止发生和发展的药。目前多用单靶向药物，疗效不佳。AD产生的原因产生的原因:乙酰胆碱转移酶活性降低或胆碱摄取能力低下,引起神经元或神经胶质营养缺乏、功能受损等,导致神经元系统功能衰退;谷氨酸受体活性过高、活性氧水平过高、炎症和病毒感染等,导致代谢通路受损、线粒体能量产生减少；-淀粉样蛋白(-amyloid,A)团块聚集,在胞质沉积后有很强的神经毒性 由Tau蛋白(神经系统广泛表达的微管蛋白)异常磷酸化:导致神经纤维缠结、细胞核或线粒体DNA 突变、蛋白质折叠错误,及RNA 或蛋白质加工不正确等。1)症状控制药症状控制药.常用药为乙酰胆碱酯酶
42、抑制剂乙酰胆碱酯酶抑制剂及其受体调节剂受体调节剂.虽不能扭转但能控制症状.是重要药物。乙酰胆碱酯酶也是昆虫神经系统中最重要的酶,用于农残检测.2)症状改善药症状改善药:以A为靶的抗AD药为研究热点。包括A形成和聚集抑制剂及清除剂。在研的有tarenflurbil(A免疫疫苗),tau聚集抑制剂亚甲蓝等.3)多靶点药物多靶点药物.开发中的药物不仅调节乙酰胆碱,对多个AD 特征性病变(如神经元凋亡、A 沉积、tau 蛋白过磷酸化等)和神经营养或神经再生也有作用。4)中药多靶向抗中药多靶向抗AD药物药物:姜黄素姜黄素:抗氧化和抗炎,高效阻止A 缠结,还是很好的Cu2+等金属离子螯合剂。对AD 有预防
43、作用,长期食姜黄食物的印度农民,65 岁以上AD 患率仅1%。石杉碱甲石杉碱甲:选择性抑制乙酰胆碱酯酶,有保护神经线粒体等多重作用。含含6 味中药的新复方参乌胶囊及其有效成分味中药的新复方参乌胶囊及其有效成分二苯乙烯苷二苯乙烯苷:在多种拟AD 动物模型上对AD发病的多个靶点和环节起作用,有神经营养和神经保护作用.植物雌激素替代治疗植物雌激素替代治疗:雌激素雌激素有抗AD 作用,绝经期开始进行雌激素替代治疗可减少AD 风险。黄酮类植物雌激素(ER 激动剂松果菊苷,甘草苷,甘草素,染料木黄酮、染料木苷、大豆黄素、大豆黄苷、芒柄花素和牛尿酚)有神经保护和神经营养作用,一定程度上对抗谷氨酸和A 引起的
44、海马神经元损伤.AD 靶向治疗药物靶向治疗药物4.糖尿病药物作用靶点糖尿病药物作用靶点主要酶靶主要酶靶:-葡萄糖苷酶(小肠内水解-1,4-糖苷键生成单糖):竞争性和可逆性抑制剂.葡萄糖激酶(GK):葡萄糖-6-磷酸酶醛糖还原酶(AR)二肽肽激酶(DPP-)蛋白激酶C(PKC)蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)糖原合酶激酶3(GSK-3)一氧化氮合酶(NOS)血管紧张素转换酶(ACE)肉碱酯酰转移酶、(CPT、)过氧化物酶增殖激活受体(PPAR)糖代谢酶蛋白磷酸化酶天然靶点药物研究模式天然靶点药物研究模式n靶点(已知)确立n筛选系统与检测方法确立n大量提取物的筛选(几百种),可
45、组合n活性成分分离纯化n结构解分析n活性比较,找出作用强的几中n细胞,组织,动物实验(可委托)n临床试验酶活性测定九九.天然药物提取分离与新靶点药物筛选天然药物提取分离与新靶点药物筛选 1.天然药物提取天然药物提取,分离与制备分离与制备提取分离新方法提取分离新方法:柱层析提取法,电泳提取法浓缩新方法浓缩新方法:树脂浓缩法天然药物制备天然药物制备:虫草素,喜树碱,姜黄素,二苯乙烯类,河豚素,中药提取物基因工程生产药用成分基因工程生产药用成分:白藜芦醇,神秘果素(糖尿病辅助药)和豆豉激酶(溶栓药)的微生物与植物基因工程生产 2.天然靶点药物天然靶点药物:核苷酸代谢有关的靶点药物筛选腺苷脱氨酶腺苷脱
46、氨酶抑制剂:筛选出4种有效的提取物,鉴定2种有效成分拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂:喜树碱的提取分离与结构修饰、转化 核糖核苷酸还原酶核糖核苷酸还原酶抑制剂:筛选模型的构建(基因克隆与基因工程菌表达)通过靶点研究中药有效成分通过靶点研究中药有效成分天然药物制备方法天然药物制备方法提取提取浓缩浓缩分离分离,纯化纯化鉴定鉴定,定性定量分析定性定量分析植物种类,器官,发育期,地点,前处理(固定,干燥,粉碎)等目标物质:种类,性质,含量,分布等提取方法,溶剂,提取时间,用量,温度,次数等离心,沉淀,酸碱度,萃取,重溶,结晶,膜过滤等层析分离:大孔树脂,聚酰胺,离子交换,凝胶/分子筛,硅胶等LC,HPLC,
47、沉淀,结晶/重结晶UV,IR,HPLC,GC,MS,NMR,电泳,特殊化学反应,颜色反应浓缩干燥生物材料产物产物最新的提取方法最新的提取方法柱层析提取法提取活性成分柱层析提取法提取活性成分原理和理论：提取原理和理论：提取=溶解溶解+洗脱洗脱技术技术浸泡沥滤动态逆流循环重力+层析层析洗脱洗脱分离虫草素的提取与分离制备虫草素的提取与分离制备Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster mediumLarge amounts of solid medium
48、 containing cordycepin,used in the industrial production of Cordyceps militaris through solid fermentation,are discarded as waste and contaminate the environment.Dr Hai-Hang Li and his team from the Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development at the South China Normal Univers
49、ity in Guangzhou,China,have developed a new column chromatographic extraction(CCE)method for the extraction of cordycepin from this waste and a preparation method for further separation and purification.The study,which was published in the Journal of Chromatography B 877(22),2135-2141(2009),formed p
50、art of a larger research project on“Technologies for Profitable Environmental Waste Treatments”,which included finding the values and usage of environmental waste and developing technologies to use them profitably.“The key point for profitable treatment of waste is to develop a simple and useful tec
