1、枯草芽孢杆菌的分离纯化目录 菌种简介 分离步骤 生理生化鉴定 发酵条件的优化 脂肽类抗生素的提取酸沉淀法 脂肽类抗生素的HPLC定量检测 讨论菌种简介 无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养 产生的脂肽类抗生素具有很强的抗真菌、病毒、肿瘤、支原体活性，在防治植物病害上具有广阔的应用前景。分离原理 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢
2、杆菌。分离步骤（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。（2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。51m
3、g），充分振荡，25min后如培养液呈红色，即为试验阳性。培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培养4天，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（约0.（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。06MPa（8lbf/in2）30m
4、in灭菌脂肽类抗生素的HPLC定量检测脂肽类抗生素的提取酸沉淀法脂肽类抗生素的提取酸沉淀法取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。原理：不同种
5、类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）生理生化鉴定 一 过氧化氢酶测定 将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。二 需氧性试验 原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。操作步骤：菌液穿刺接种到上述培养基中，一
6、般于培养37天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌三、乙酰甲基甲醇实验原理：有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被氧气成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，即表示试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节PH 6.5，每管分装45ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌步骤：将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培养4天，取培养液（约2
7、ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（约0.51mg），充分振荡，25min后如培养液呈红色，即为试验阳性。四 淀粉水解原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。步骤：将培养基做成平板，凝固后取菌种点种于平板上（每皿点种2点），一般于30摄氏度培养24天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯种后，
8、从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37培养1-2天后备用发酵条件的优化 将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。发酵过程中采用单因素试验方法,考察不同培养温度(26、28、30、32、34、36)、培养时间(26、32、38、44、50、80h)、接种量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy培养基、Landy修饰培养基、Landy修饰培养基、LB培养基、无机盐培养基)对脂肽类抗生素产量的影响。结果表明,最佳培养条件为Landy培养基,初始
9、pH70,接种量3%,发酵培养温度30,发酵时间38h。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法 培养结束后,7000r/min离心10min,取上清，加 HCl调节pH为50、45、40、35、30、25、20,7000r/min离心10min,收集沉淀。将沉淀在60 的烘箱中干燥18h,称重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。比较不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂肽类抗生素所需的最佳pH值。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。06MPa（8lbf/in2）30min灭菌经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜
10、面上，置37培养1-2天后备用枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养 产生的脂肽类抗生素具有很强的抗真菌、病毒、肿瘤、支原体活性，在防治植物病害上具有广阔的应用前景。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。枯草芽孢杆菌的分离纯化将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法广泛分布在土壤及腐败的有机物中。2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。培养
11、基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。枯草芽孢杆菌的分离纯化5，每管分装45ml，0.脂肽类
12、抗生素的HPLC定量检测 将脂肽类抗生素粗提物过Sephadex LH-20层析柱，每管收集液分别经真空干燥后,加入02ml乙醇溶解。对每管乙醇溶液进行平板抑菌试验,试验真菌为油菜菌核病菌,将具有抑菌活性的收集液合并在一起,用离心浓缩仪浓缩至完全干燥,即为脂肽类抗生素的干重。原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。5，每管分装45ml，0.（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有
13、气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。比较不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂肽类抗生素所需的最佳pH值。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被氧气成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，即表示试验阳性。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法脂肽类抗生素的提取酸沉淀法脂肽类抗生素的HPLC定量检测取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。5，每管分装45ml，0.广泛分布在土壤及腐败的有机物中。将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200
14、r/min培养24h作为种子菌。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。发酵过程中采用单因素试验方法,考察不同培养温度(26、28、30、32、34、36)、培养时间(26、32、38、44、50、80h)、接种量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、
15、8、9)、培养基(Landy培养基、Landy修饰培养基、Landy修饰培养基、LB培养基、无机盐培养基)对脂肽类抗生素产量的影响。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。将沉淀在60 的烘箱中干燥18h,称重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气
16、的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。培养基：在肉汤琼脂中添加0.若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌06MPa（8lbf/in2）30min灭菌06MPa（8lbf/in2）30min灭菌（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。06MPa（8lbf/in2）30min灭菌脂肽类抗生素的HPLC定量检测原理：不同种类的芽孢杆菌对
17、氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法广泛分布在土壤及腐败的有机物中。将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。发酵过程中采用单因素试验方法,考察不同培养温度(26、28、30、32、34、36)、培养时间(26、32、38、44、50、80h)、接种量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy培养基、Landy修饰培养基、Landy修饰培养基、LB培养基、无机盐培养基)对脂肽类抗生素产量的影响
18、。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。培养结束后,7000r/min离心10min,取上清，加 HCl调节pH为50、45、40、35、30、25、20,7000r/min离心10min,收集沉淀。原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。将沉淀在60 的烘箱中干燥18h,称重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法比较不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂肽类抗生素所需的最佳p
19、H值。5，每管分装45ml，0.将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。对每管乙醇溶液进行平板抑菌试验,试验真菌为油菜菌核病菌,将具有抑菌活性的收集液合并在一起,用离心浓缩仪浓缩至完全干燥,即为脂肽类抗生素的干重。将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。2
20、%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法5，每管分
21、装45ml，0.枯草芽孢杆菌的分离纯化培养基：在肉汤琼脂中添加0.将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养12天。将纯化的菌种转接至LB平板上,37培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30、200r/min培养24h作为种子菌。2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。脂肽类抗生素的提取酸沉淀法1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。将脂肽类抗生素粗提物过Sephadex LH-20层析柱，每管收集液分别经真空干燥后,加入02ml乙醇溶解。取一载玻片，在上面加一滴310%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37培养1-2天后备用脂肽类抗生素的HPLC定量检测比较不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂肽类抗生素所需的最佳pH值。讨论 枯草芽孢杆菌脂肽类抗生素在防治植物病害上具有广阔的应用前景,但由于其产量不高使其应用受到限制，通过研究枯草芽孢杆菌的发酵技术和对其进行遗传改造可以提高脂肽类抗生素产量。
