1、微生物学基微生物学基础础 -微生物实验操作的基本要求微生物实验操作的基本要求无菌操作指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。在微生物的分离、接种、培养操作过程中防止培养物被其他微生物污染的操作技术称为无菌操作技术。创造无菌的培养环境防止在操作过程中其他微生物的侵入标准无菌室的要求：标准无菌室的要求：房间设置（外面有缓冲室）、房间设置（外面有缓冲室）、空气过滤、墙面、墙角、微生物操空气过滤、墙面、墙角、微生物操作相关设备、紫外灯等。作相关设备、紫外灯等。如条件有限，可在微生物实验室内专辟一个小房间作为无菌室。可以用板材和玻璃建造，面积4-5 平方米即可。板材和玻璃
2、隔出的无菌室 超净工作台是一种提供局部无尘无菌工作环境的垂直单向流型空气净化设备。超净工作台 生物安全柜外形与超净台类似，也提供局部无尘无菌工作环境。但它设置了风槽，气流不会吹向使用者，可以有效保护使用者。通常使用酒精灯、煤气灯，其火焰周围是无菌区域（直径10cm左右）。首先，利用高温杀死细菌，而后利用酒精燃烧时向上形成的单向气流形成一个无菌区域。火焰周围是无菌区域1、玻璃、金属等器具 干热灭菌法2、玻璃、金属、含水物品 高压蒸汽灭菌法3、金属、玻璃器具 火焰灭菌法4、液体或水溶性物质 过滤除菌法设备：电烘箱用途：用于玻璃器皿、金属器具等耐热物品的烤干和灭菌。条件：160-165，灭菌 1-2
3、小时。设备：高压蒸汽灭菌锅用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。条件：121 水蒸气 2030分钟培养基一般使用高压蒸汽灭菌法即在火焰外焰上灼烧进行灭菌。用途：接种环、接种针；涂布器；试管管口、锥形瓶瓶口等的灭菌。器具：细菌过滤器用途：不耐高温的液体、水溶性物质的除菌。细菌过滤器 我们通过一定的技术来保证目的微生物、培养基不被环境微生物污染，这些技术就是无菌操作技术。包括手部清洁消毒，用接种针、接种环、吸量管、涂布棒等工具进行各种操作等等。洗手：手部有可见灰尘时、饭前、便后，用水和肥皂洗手；Handrub（揉手）：手部较清洁时，75%乙醇或者醇基消毒剂揉手。动作：手掌-手背
4、-指缝-手指-拇指-指尖-手腕培养皿开合：单手打开和盖上皿盖，包括持皿法和皿加法两种。此操作用于制作培养基平板、接种等。持皿法皿加法包括灼烧接种环、接种、划线等。先斜放外焰灼烧接种环，然后垂直放置后继续灼烧，再斜烧金属杆。现在红外接种环灭菌器使用也比较广泛。用接种环进行接种用接种环进行划线灼烧灭菌：可以沾酒精然后灼烧，灼烧范围要包括其杆部。涂布：将菌液滴在培养基表面中央。右手拿涂布棒将菌液沿一条直线来回推动，然后沿一垂直线来回推动，平板边缘处可改变方向再涂几次。单试管操作（注意左右手的使用）双试管操作无菌操作视频1 必须明确物品的无菌区和非无菌区。工作人员需先戴帽子、口罩及洗手，并将手擦干，注
5、意空气和环境清洁。2 夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂，均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。3 无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物品和非无菌物应分开放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。（1）实验室内要经常保持清洁卫生。（2）实验室应井然有序，不得存放实验室外 及个人物品、仪器等。（3）测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。（4）实验室应具有优良的采光条件和照明设备。（5）实验室工作台面应保持水平和无渗漏，墙 壁和地面应当光滑和容易清洗。（6）实验室
6、布局要合理，一般应有准备间和无菌室。（一）一般要求（一）一般要求（1）进入实验室工作时，衣、帽、鞋必须穿戴整齐。（2）在进行高压、干燥、消毒等工作时，不得擅自离开现场，认真观察温度、时间。蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。（3）严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液溅出容器外 时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方可离开现场。（4）工作完毕，两手用肥皂洗净，必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手，然后 用水冲洗。工作服要经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。（5）实验完毕及时清理现场和实验用具，对染菌物品进行消毒灭菌处理。（6）实验结束后认真检查水、电和
7、正在使用得仪器设备，关好门窗，方可离去。（二）消防安全要求（1）注意预防供电线路老化造成的漏电着火。（2）注意设备原因导致的失火。设备超出正常使用寿命；设备出现故障未及时发现和维修。需过夜而无人看守的恒温培养箱和干 燥鼓风箱等。仪器操作不当，温度设置过高，引起失火。恒温干燥鼓风箱（3）防止未关电源引起失火。（4）防止操作不慎，使火源接触易燃物质，引起着火。（5）避免出现爆炸事故。灭菌锅（三）药品使用安全易挥发吸入过多影响健康；致癌；剧毒；腐蚀实验仪器，伤害皮肤，眼睛等。（四）细菌感染和污染 细菌易发生变异，在某些特定条件下由非致病菌转变为致病菌。因此应注意防范，不可麻痹大意。（五）辐射损伤 无菌操作前用紫外灯照射消毒，强紫外线对人体有害，应避免接触。见课本第20页。课后作业1.如何实现无菌操作？2.请自拟一套微生物实验室仪器设备采购计划。
