1、一、种子制备工艺及质量控制二、常用代谢参数三、基质浓度变化及控制四、温度对发酵的影响及控制五、溶解氧对发酵的影响及控制六、pH对发酵的影响及控制七、CO2对发酵的影响八、泡沫的形成及控制九、染菌分析及控制第五节 发酵过程及控制 发酵是一个复杂的生物化学过程影响因素很多：菌种、培养基、温度、pH、溶氧、污染等。一、种子制备工艺及质量控制 菌种是发酵的关键，从一个保存的菌种，到生产上使用的种子，如果按几十几百吨的发酵规模，10的种子量(接种量)计，需要几吨几十吨的种子。(一)、作为种子的要求：1、细胞的生活力强，移种至发酵罐后能迅速生长2、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求3、无杂菌污染4、生
2、理形状稳定、保持稳定的生产能力(二)、种子制备的工艺流程及对发酵的影响 1、工艺流程2、接种时间(种龄)和接种量接种时间：对数生长期，菌体量还未达最高峰接种量：决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度 谷氨酸棒状杆菌：1 大多数抗生素发酵：510%个别的发酵：2025接种量过小，除延长发酵周期外，往往还引起其它不正常情况接种量过高，会使菌体生长过快，培养液粘度过高，造成供氧不足3、种子质量检查与判断 检查pH 检查培养基灭菌后糖、氮、磷等的含量 检查菌丝的形态、浓度、种子液外观等 无菌检查 稳定性检查 其它参数检查：某种酶的活性、产物量等(三)、影响种子质量的因素：1、原材料质量 2、培养温度、湿度
3、、时间等 3、种子罐通气量 4、冷藏时间 5、传代次数二、常用代谢参数1、物理参数、温度、罐压、搅拌速度、空气流量、表观粘度、发酵液重量2、化学参数、基质浓度、pH、产物浓度、DNA量、关键酶、溶解氧、排气中的氧含量、排气中的CO2含量3、生物参数、菌丝形态、菌丝干重或湿重、菌体比生长速率、氧的比消耗速率、糖的比消耗速率、氮的比消耗速率、产物的比生产速率三、基质浓度变化及控制1、碳源浓度变化及控制 碳源物质是发酵过程中菌体生长和产物合成的能量和碳素的来源。在发酵的前期，碳源物质主要用于生长，消耗较快，在发酵后期，碳源物质主要用于产物合成，消耗速度放缓。快速利用的碳源物质：对生长有利，对次级代谢
4、产物的形成有抑制作用。缓慢利用的碳源物质：对延长产物的合成是有利的，尤其是次级代谢产物。到发酵的中后期，发酵液中的残糖基本耗尽，影响产物的合成如果采用丰富碳源的培养基，又会产生其它的问题，如培养基浓度过高，影响通气搅拌，过高的碳源浓度也抑制菌体的生长。解决的方法是采取“中间补料”补糖的方法：连续滴加补糖、小量多次间歇补糖 大量少次补糖 “中间补料”可以延长产物的产生时间，推迟菌体的自溶时间，增加了发酵液的体积，而使发酵单位大幅度上升。2、氮源浓度变化及控制 氮源物质主要用于菌体中蛋白质、核酸等含氮物质的合成，有些发酵产物中含有氮。发酵前期，氮源物质随菌体浓度的急剧增加而迅速减少，发酵中期，氮源
5、(氨基氮)的下降速度比较缓慢，发酵后期，由于菌体自溶，氨基氮会回升。氮源物质往往抑制次级产物的合成。快速利用的氮源物质：如氨水、铵盐促进菌体生长。缓慢利用的氮源物质：有利于延长产物的合成期。一般情况下，发酵培养基中同时含快速利用的氮源和缓慢利用的氮源物质。如果氮源物质投料多，会造成菌体生长快，但菌体衰老也快。解决方法：“中间补料”。四、温度对发酵的影响及控制(一)、温度对微生物和发酵的影响 1、不同的菌、不同的发酵对温度的要求不一样。2、菌体生长的最适温度与产物形成的最适温度往往不一致。3、菌种在不同的生长期对温度的敏感性不同。温度对发酵的影响归根结底是影响酶的活力。菌种 温度（）129961
6、71542T-613最适生长温度最适产物形成温度30-323432-3434-3630-3434-3632-3636-38谷氨酸菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度（二）、温度在发酵中的变化规律生物热的变化规律Q生物热生物热(4.19KJ/m3 h)时间时间(h)（三）、温度的控制 依靠夹层或蛇管 目前许多发酵罐都采用自动化控制五、溶解氧对发酵的影响及控制溶解氧：溶解于液体(发酵液)中的氧氧难溶于水，在25，1atm下，氧在水中的溶解度为0.26m mol/升临界溶解氧浓度：满足微生物呼吸的最低限度的溶解氧浓度。一般好气性微生物约为0.0030.05m mol/升之间。微生物名称温度()C临
7、界(m mol/升)固氮菌300.018-0.049大肠杆菌150.0031大肠杆菌37.80.0082酵母菌200.0037酵母菌34.80.0046橄榄型青霉菌240.0022橄榄型青霉菌300.009橄榄型青霉菌320.02影响微生物需氧量的因素1、菌种2、菌体浓度3、菌龄4、培养基(一)影响需氧和供氧的因素影响供氧量的因素1、搅拌2、通气量3、空气分布管的结构4、发酵罐的液柱高度/直径比5、培养液的物理性质6、泡沫溶解氧的控制：应满足需氧供氧（二）溶解氧的控制需氧方面控制最适的菌体浓度供氧方面：1、改变气体成份2、提高搅拌速度3、增加挡板4、增加通气量5、提高罐压几个概念：呼吸强度：指
8、一克干菌体，在一小时内所需氧的毫摩尔数摄氧量：指一升发酵液，在一小时内所需氧的毫摩尔数通气量：指一分钟内，发酵液的体积比通过发酵液的空气体积六、pH对发酵的影响及控制(一)、pH值对发酵的影响：1、pH影响酶的活性 2、pH影响微生物细胞膜的带电状况，从而影响微生物对养料的吸收和对代谢产物的分泌 3、pH影响培养基中某些营养物质的可给性 4、pH可能改变培养基的氧化还原电位 5、pH会影响某些微生物的形态（二）、影响pH变化的因素：1、菌种特性 2、培养基组成 3、发酵条件(三)、pH在发酵过程中的变化规律 在发酵前期，菌体生长缓慢，糖分解的少，铵离子利用的也少，所以pH变化缓慢。随菌的生长，
9、菌分解了含氮有机物，释放出铵，培养基的pH会缓慢上升。当菌转入对数生长期，由于菌体大量繁殖，大量利用糖和铵离子，培养基的pH逐渐下降。在生长后期，由于菌体自溶，释放出铵，pH又回升。1、调节培养基的配方2、补料控制 加酸、加碱 流加无机氮源 加碳源物质3、调节通气量（四）、发酵过程中pH的调节七、CO2对发酵的影响CO2是微生物的代谢产物，同时它往往也是合成所需的一种基质排气中CO2的浓度与细胞量有一定的联系，通过测定CO2的生成，可用来估算菌的生长速率和细胞量溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等发酵具有抑制或刺激作用。(一)、CO2 对菌体生长及 产物形成的影响p当排气中的CO2 浓度高
10、于4时，菌体碳水化合物的合成及呼吸速率下降p发酵液中的CO2浓度为1.6102 mol时，会严重抑制酵母菌的生长pCO2 影响产黄青霉的形态CO2 对氨基酸合成的影响进气中CO2含量()紫苏霉素相对产量01234100661500CO2 对紫苏霉素生物合成的影响(二)、排气中CO2 与菌体生长的关系(三)、排气中CO2 与pH的关系 RQ(呼吸商)=CEOOUTCEO：CO2释放率(molCO2/Lh)OUT：菌耗氧率(molO2/Lh)(四)、排气中CO2与 排气中O2之间的关系酵母菌：RQ=0.93 生成柠檬酸RQ=1.0 生成菌体RQ1.1 生成乙醇青霉素发酵RQ=0.909 菌体生长R
11、Q=1 菌体维持RQ=4 青霉素生产八、泡沫的形成及控制1、气泡中的空气有隔热作用，影响灭菌2、泡沫多会从轴封溢出，容易造成染菌3、降低了发酵罐的装料系数4、严重时停搅拌，影响正常的发酵过程泡沫的危害1、通气搅拌的强烈程度2、培养基的配比及原材料3、灭菌4、种子和接种量5、培养液本身的性质变化6、染菌影响泡沫消长的因素1、机械消泡 消沫桨 引出罐外消泡后再引回罐内2、化学消沫 油脂 泡敌泡沫的消除九、染菌分析及控制（一）染菌原因分析1、种子带菌或怀疑种子带菌 9.642、罐压跌零造成染菌 0.193、培养基未彻底灭菌 0.794、空气系统带菌 19.965、泡沫冒顶 0.486、夹层穿孔 12
12、.367、其它管道穿孔 5.898、接种管穿孔 0.599、阀门泄漏 1.5410、搅拌轴密封泄漏 2.0911、罐基漏 1.5412、其它设备漏 10.1313、操作问题 10.1514、原因不祥 20.91某发酵厂染菌现象的统计分析1、种子带菌或怀疑种子带菌 102、培养基未彻底灭菌 13、空气系统带菌 204、操作问题 105、设备问题 406、原因不祥 20染菌规模：大批发酵罐染菌、部分发酵罐染菌、个别发酵罐染菌染菌时间：早期、中后期染菌种类：芽孢杆菌、小球菌、霉菌、酵母菌、水生细菌（二）防止染菌的措施主要是加强管理：1、培养基的无菌试验2、种子的无菌试验3、设备的定期检查、维修4、严
13、格、规范的操作（三）染菌后的挽救措施1、种子罐染菌：倒罐，从其它未染菌的罐移种2、发酵罐早期染菌：调酸以抑制杂菌生长；加入药物抑制杂菌生长；培养基重新灭菌，转入发酵旺盛的发酵液3、发酵罐后期染菌：根据情况，提前放罐（四）噬菌体污染与防治 噬菌体在自然界广泛存在，噬菌体污染轻则减产，重则倒罐，长时间停产。1、发酵前期菌丝量不上升或回落2、pH逐渐上升达8.0以上，不下降3、糖耗缓慢或停止4、产生大量泡沫，有时发酵液呈粘状可拔丝5、谷氨酸产生量甚少，或增长极为缓慢，或停止6、镜检菌体数少，菌体不规则7、发酵液残糖高，颜色重(红色、灰色)，有刺激性气味噬菌体污染的征兆(以谷氨酸发酵为例)1、选育抗噬菌体菌系2、保护环境3、加噬菌体抑制剂防止噬菌体污染的常用方法1、接入成年菌种2、改变菌种3、7080灭活噬菌体，加倍接种污染噬菌体后的挽救措施
