1、 昆明学院医学院病原生物学教研室昆明学院医学院病原生物学教研室 教学目标1.1.熟悉常用的纯种细菌的接种方法。熟悉常用的纯种细菌的接种方法。2.2.掌握标本中细菌的分离培养技术。掌握标本中细菌的分离培养技术。3.3.了解细菌广泛分布于自然界及正常人了解细菌广泛分布于自然界及正常人体，树立体，树立“有菌观念有菌观念”。4.4.深刻认识深刻认识“无菌操作无菌操作”对于微生物实对于微生物实验及医药学实践的重要性。验及医药学实践的重要性。5 5进一步理解进一步理解“正常菌群正常菌群”的概念。的概念。实验主要内容实验主要内容1 1录相：细菌的培养方法录相：细菌的培养方法2 2操作：操作：空气中细菌的检查
2、空气中细菌的检查 （沉降法（沉降法 血平板血平板 1 1块块/6/6人）人）呼吸道细菌的检查呼吸道细菌的检查 （咽拭子法培养（咽拭子法培养 血平板血平板 1 1块块/3/3人）人）随身物品的细菌检查（手指消毒前后随身物品的细菌检查（手指消毒前后 普通平板普通平板1 1块块/3/3人）人）细菌的接种法（液体、半固体、固体细菌的接种法（液体、半固体、固体 1 1套套/3/3人）人）材料：材料：大肠埃希菌培养物大肠埃希菌培养物 （1 1支支/6/6人）人）碘酒、碘酒、75%75%酒精、棉签等酒精、棉签等 （1 1套套/6/6人）人）培养基的制备培养基的制备一、培养基一、培养基（culture med
3、iumculture medium）n由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。（一）培养基的类型及应用（一）培养基的类型及应用1、按用途划分、按用途划分1）基础培养基）基础培养基 能满足一般细菌生长繁殖的营养需要，如肉能满足一般细菌生长繁殖的营养需要，如肉汤（包括牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等）。汤（包括牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等）。2）营养培养基）营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等。酵母浸膏等。3）鉴别培养基）鉴别培养基4）选择培养基）选择培养基 用于鉴别不同类型细菌的培养基。特定的化学用于鉴别不同类型细菌的培养基
4、。特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种细菌与其他细菌区分开来化，可将该种细菌与其他细菌区分开来。将某种细菌从混杂的细菌群体中分离出来的培养将某种细菌从混杂的细菌群体中分离出来的培养基。根据不同种类细菌的特殊营养需求，在培养基中基。根据不同种类细菌的特殊营养需求，在培养基中加入相应的特殊营养物质；或者加入某些化学物质，加入相应的特殊营养物质；或者加入某些化学物质，抑制不需要的细菌生长，有利于所需细菌的生长。抑制不需要的细菌生长，有利于所需细菌的生长。5）厌氧培养基）厌氧培养基SS琼脂培养基琼脂培养基 大肠埃希菌大肠埃希菌沙
5、门菌沙门菌志贺菌志贺菌2、根据物理状态划分、根据物理状态划分 n液体培养基：增菌n固体培养基（琼脂浓度为23）：增菌，分离培养n半固体培养基（琼脂浓度为0.2-0.5%）：动力检查，保种 液体培养基液体培养基 固体培养基固体培养基 半固体培养基半固体培养基（二）细菌生长繁殖的条件（二）细菌生长繁殖的条件1 1充足的营养物质；充足的营养物质；2 2适宜的温度；适宜的温度；3 3合适的酸碱度（合适的酸碱度（phph）；）；4 4必要的气体环境；必要的气体环境；温温 度度n嗜冷菌嗜冷菌 (1(10-15)0-15)n嗜温菌（嗜温菌（30-4030-40）：绝大多数病原菌：绝大多数病原菌n嗜热菌嗜热菌
6、（50-8550-85）pH n嗜中性菌（5 to 8）n嗜酸性菌（below 5.5）n嗜碱性菌（above 8.5）n多数病原菌最适酸碱度为PH7.2-7.6q霍乱弧菌耐碱 PH8.4-9.2q结核分支杆菌耐酸 PH6.5-6.8气体环境气体环境n氧和二氧化碳按细菌对氧的需求可分为四种类型：按细菌对氧的需求可分为四种类型：（1）专性需氧菌（）专性需氧菌（obligate aerobe,O2 20%）（2）兼性厌氧菌（）兼性厌氧菌（facultative anaerobe,O2:Yes or no）（3）微需氧菌（）微需氧菌（microaerophilic bacterium,O2:210%
7、）（4）专性厌氧菌（）专性厌氧菌（obligate anaerobe,O2:No）某些细菌如奈瑟菌在培养时需要提供某些细菌如奈瑟菌在培养时需要提供5-10%二氧化碳；二氧化碳；二、细菌在培养基中的生长现象二、细菌在培养基中的生长现象1固体培养固体培养n单个微生物在适宜的固体培养基表面生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的有一定形态结构的细菌集团，称为菌落（colony）。n菌落特征是鉴别细菌的重要依据之一。2 液体培养液体培养表面生长表面生长 沉淀生长沉淀生长 混浊生长混浊生长 3 半固体培养半固体培养q常用于检查细菌动力常用于检查细菌动力无动力无动力 有动力有动力本次试验的操作本次试验的操
8、作：1.空气中细菌的检查（沉降法，血平板）空气中细菌的检查（沉降法，血平板）2.呼吸道细菌的检查（呼吸道细菌的检查（咽拭子或咽拭子或咳碟培养，咳碟培养，血平板）血平板）3.随身物品细菌检查（普通平板）随身物品细菌检查（普通平板）4.细菌的接种法：液体、半固体、固体培养细菌的接种法：液体、半固体、固体培养基基 检查空气中细菌的方法很多，沉降法是其中的一种。它是利用含有细菌的尘粒或气溶胶粒因重力作用而自然下降于培养基表面，通过细菌培养，计数其菌落数，而粗略地进行评估。操作：将血平板打开盖，放到教室的四个角上，静止15分钟后，合上盖后送37孵箱培养。沉降法简单易行，缺点是不够准确。但它客观地反映了空
9、气污染的程度和卫生通风状况，对手术室、食品业等有重要的参考意义，是判断空气污染的指标之一。据推算，据推算，每每100cm100cm培养基在空气中暴露培养基在空气中暴露5 5分钟，其表面接受自然沉降的细菌数约相当分钟，其表面接受自然沉降的细菌数约相当于于1010升空气中所含的细菌量。升空气中所含的细菌量。所以：所以：每每mm空气中活菌数空气中活菌数=（100cm100cm培养基上培养基上菌落平均数菌落平均数/30/30）x1000 x1000。鼻咽喉及口腔是人体与外界相通的腔道，常鼻咽喉及口腔是人体与外界相通的腔道，常常有不同种类的细菌存在。这些细菌常是条件常有不同种类的细菌存在。这些细菌常是条
10、件致病菌，在一般情况下并不致病，但是当机体致病菌，在一般情况下并不致病，但是当机体的抵抗下降时，可引起疾病而对机体造成危害。的抵抗下降时，可引起疾病而对机体造成危害。由于寄居人体的关系，这些细菌对营养的由于寄居人体的关系，这些细菌对营养的要求较高，所以常用含血的培养基进行分离。要求较高，所以常用含血的培养基进行分离。鼻咽喉及口腔中细菌的检查鼻咽喉及口腔中细菌的检查 咳碟试验咳碟试验方法：方法：（1 1块块3 3人）人）打开血平板，将平板置于口腔前约打开血平板，将平板置于口腔前约15cm15cm处，处，对准培养基表面用力咳嗽对准培养基表面用力咳嗽3 34 4次，然后盖好平次，然后盖好平板盖，放置
11、于板盖，放置于3737孵箱内培养孵箱内培养2424小时观察小时观察结果。结果。在人体的皮肤表面有多种细菌存在，用水洗手或在人体的皮肤表面有多种细菌存在，用水洗手或用肥皂洗手，可以除去皮肤上的污垢和灰尘，从而减少用肥皂洗手，可以除去皮肤上的污垢和灰尘，从而减少手上细菌的数量，但并不能有效的杀死细菌。而日常医手上细菌的数量，但并不能有效的杀死细菌。而日常医疗、试验工作中常用的化学消毒剂如碘酒、酒精等有很疗、试验工作中常用的化学消毒剂如碘酒、酒精等有很好的杀菌作用，它们不仅对细菌的繁殖体，对芽孢也有好的杀菌作用，它们不仅对细菌的繁殖体，对芽孢也有一定的杀灭效果，所以在临床医疗中广泛应用。一定的杀灭效
12、果，所以在临床医疗中广泛应用。正常人体皮肤及随身物品的细菌检查正常人体皮肤及随身物品的细菌检查1 1、将平板底部用、将平板底部用markmark笔划线分成均匀的笔划线分成均匀的8 8个区，分别标个区，分别标记为。记为。2 2、用右手的食指在区上轻轻按一下，然后用肥皂在流、用右手的食指在区上轻轻按一下，然后用肥皂在流水下将手洗干净，用无菌棉签拭干右手食指皮肤上的水，水下将手洗干净，用无菌棉签拭干右手食指皮肤上的水，再轻轻在区培养基上按一下。再轻轻在区培养基上按一下。3 3、用左手食指轻轻在区按一下，然后用棉签蘸碘酒消、用左手食指轻轻在区按一下，然后用棉签蘸碘酒消毒左手食指皮肤，待干后轻轻在区按一
13、下。毒左手食指皮肤，待干后轻轻在区按一下。4 4、任取随身物品在区各按一下。、任取随身物品在区各按一下。5 5、盖好平板，送、盖好平板，送3737孵箱培育孵箱培育2424小时后观察结果。小时后观察结果。操作与注意事项（操作与注意事项（1块块3人）人）注意事项：注意事项：用手指或物品按培养基时，接触面可稍微用手指或物品按培养基时，接触面可稍微大一些，但切勿用力，否则，易将培养基压破，大一些，但切勿用力，否则，易将培养基压破，影响结果的判断。如果不慎压破，可在临近未影响结果的判断。如果不慎压破，可在临近未破处重新按一下。破处重新按一下。三线法分离接种 细菌的分离接种细菌的分离接种1.琼脂平板划线分离接种法（固体培养琼脂平板划线分离接种法（固体培养基）基）三线法三线法2.穿刺接种法（半固体培养基）穿刺接种法（半固体培养基）3.液体培养基接种法液体培养基接种法 接种时要注意无菌操作，避免污染，防止细接种时要注意无菌操作，避免污染，防止细菌外溢污染环境。菌外溢污染环境。斜面培养基接种半固体穿刺液体培养基接种思考题思考题1.“三线法三线法”分离接种细菌的主要目的是么？分离接种细菌的主要目的是么？2.为什么有的时候在接种细菌后，通过培养为什么有的时候在接种细菌后，通过培养没有细菌生长？没有细菌生长？3.酒精的最佳杀菌浓度？酒精的最佳杀菌浓度？
