1、微生物(microorganism)结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。没有细胞结构的低等生物。例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等小型原生动物等等微生物的利用：微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理抗生素；酒；腐乳；污水治理历史小资料 1919世纪中期，关系到法国经济命脉的世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发
2、现，经过一番研究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。杂菌。保持培养物纯净，保持培养物纯净，保证无杂菌污染很保证无杂菌污染很重要！重要！大肠杆菌的培养与分离一、大肠杆菌（E.coli）兼性厌氧的肠道内的共生菌群兼性厌氧的肠道内的共生菌群合成维生素合成维生素B B和维生素和维生素K K，供机体利用；，供机体利用；产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。腐生菌滋生。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌作为一种工程菌，作为一种工程菌，在基因工程技术中被广泛采用。在基因工程技术中被广泛采用。例：大规模生产治疗糖尿病
3、的药物例：大规模生产治疗糖尿病的药物胰岛素胰岛素培养基（culture media）按照微生物对营养物质的不同需求，配制按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。出的供其生长繁殖的营养基质。提供微生物生长的条件提供微生物生长的条件：合适的温度：合适的温度：25-3725-37合适的合适的pHpH：细菌：细菌 6.5-7.5 6.5-7.5 中性偏碱中性偏碱 真菌真菌 5.0-6.0 5.0-6.0 中性偏酸中性偏酸营养成分：营养成分：含有含有碳源、氮源、生长因子、水碳源、氮源、生长因子、水和无机盐和无机盐。LB培养基的配方培养基成分培养基成分各成分的量各成分的量蛋白胨蛋白
4、胨0.5g酵母提取物酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至加至50ml固体培养基的配制：每固体培养基的配制：每50ml 液体培养基添加液体培养基添加1g 琼脂琼脂培养基种类培养基种类 培养基（培养液）是由人工方法配制培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。合营养液。（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基和和液体培养液体培养基、半固体培养基基、半固体培养基。（2 2）按功能分：）按功能分：选择培养基选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基。（3 3）按成分分：）按成分分：天然培养基天然培养基和和合成培养
5、基合成培养基。1.1.培养基的类型培养基的类型固体培养基：菌落固体培养基：菌落液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长半固体培养基：半固体培养基：无动力无动力 有动力有动力(弥散弥散)2.2.培养基的用途培养基的用途液体培养基：增菌、工业生产液体培养基：增菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、活菌计数、固体培养基：纯化（分离），鉴定、活菌计数、保藏菌种保藏菌种半固体培养基：动力检测半固体培养基：动力检测无菌技术 获得纯净培养物的关键是获得纯净培养物的关键是防止防止外来杂菌的入侵外来杂菌的入侵，无菌技术围绕着，无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开。如
6、何避免杂菌的污染展开。（1 1）消毒：）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。物的过程。消毒与灭菌消毒与灭菌（2 2）灭菌：）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。普通也是最重要的技术。以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有所有微生物，包括微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌完全无菌的过程。的过程。消毒的方法1、100煮沸煮沸5-6min2、巴氏消毒法、巴氏消毒法 70-75 下煮下煮30min或或 80
7、下煮下煮15min3、用、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源、氯气消毒水源5、紫外线消毒、紫外线消毒灭菌的方法1、灼烧灭菌灼烧灭菌2、干热灭菌、干热灭菌 160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌 100kPa、121 下下 维持维持15-30min。灭菌锅 检查水位检查水位 设定高压温度及时间，设定高压温度及时间，121121 20min 20min 放入待灭菌物品放入待灭菌物品 加热，加热，并并打开放气阀打开放气阀排排冷空气冷空气 关闭放气阀关闭放气阀继续升温升压继续升温升压 待温度降低至待温度降低至8080以下开以下
8、开盖，取出物品烘干盖，取出物品烘干无菌技术操作要点1、实验操作空间实验操作空间,操作者的衣着和手操作者的衣着和手 2、微生物培养的器皿用具和培养基等、微生物培养的器皿用具和培养基等 3、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在应在 进行。进行。4、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。与周围的物品相接触。清洁和消毒清洁和消毒灭菌灭菌酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序培养基配制培养基配制器具和培养基灭菌器具和培养基灭菌倒平板倒平板微生
9、物接种（斜面微生物接种（斜面液体）液体）恒温箱中培养恒温箱中培养分离纯化（分离纯化（液体液体 平板划线平板划线）培养，培养，菌种的保存菌种的保存（斜面）（斜面）准备准备阶段阶段培养培养阶段阶段称量蛋白胨蛋白胨酵母提取物酵母提取物NaCl液体LB培养基的配方培养基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml 固体LB培养基每100ml 液体LB培养基中加入2g琼脂，摇匀，灭菌。灭菌灭菌培养皿壁上培养皿壁上不能沾有培不能沾有培养皿，否则养皿，否则容易污染。容易污染。1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可
10、以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。怎样纯化分离我们需要的大肠杆菌呢？怎样确保大规模培养繁殖起来的细菌是一个纯种群体呢？将待分离样品进行一定的稀释，并使微将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞尽量以分散状态存在，然后使其生物的细胞尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单
11、菌落。长成一个个纯种单菌落。大肠肝菌的分离大肠肝菌的分离微生物的分离技术：微生物的分离技术：稀释稀释涂布分离法涂布分离法平板划线分离法平板划线分离法稀释法稀释法平板划线分离法一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然前都要灼烧接种环？在划
12、线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？进行划线？答：答：以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作
13、第二次以及其后的划线操作时，为什在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？么总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。4.4.进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？答：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸答：恒温培养时，培养基中的水分会以
14、水蒸气的形式蒸发，如果正放培养皿，则水分形成的气的形式蒸发，如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面且扩散开。若培养基中一水滴会落入培养基表面且扩散开。若培养基中一行成菌落，则菌落中的菌会随水扩散开，菌落间行成菌落，则菌落中的菌会随水扩散开，菌落间相互影响，很难再分离成单菌落，答不到分离目相互影响，很难再分离成单菌落，答不到分离目的。的。因此，倒置培养皿可以因此，倒置培养皿可以防止皿盖上的水珠防止皿盖上的水珠落入培养基落入培养基，造成污染。，造成污染。涂布分离法菌种的保存 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法
