1、第一章第一章 核酸的分子结构、性质和功能核酸的分子结构、性质和功能遗传物质是什么遗传物质是什么?其功能是什么其功能是什么?作为遗传物质的分子应具备的基本特点作为遗传物质的分子应具备的基本特点1.必须稳定地含有有机体细胞结构、功能、发育必须稳定地含有有机体细胞结构、功能、发育和繁殖的各种信息和繁殖的各种信息2.必须能够精确地复制，这样后代细胞才能具有必须能够精确地复制，这样后代细胞才能具有和亲代细胞相同的信息和亲代细胞相同的信息3.必须能够变异，如果没有变异，生物就不能改必须能够变异，如果没有变异，生物就不能改变而适应环境，进化也就不会发生变而适应环境，进化也就不会发生1952年美国微生物学家年
2、美国微生物学家A.D.Hershey-Chase 噬菌体转导实验噬菌体转导实验 transduction1928年年Griffith,1944年美国细菌学家年美国细菌学家O.T.Avery 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验 transformationDNA是遗传物质是遗传物质格里费斯格里费斯(Griffith F.，1928)的肺炎双球菌定向转化试验：的肺炎双球菌定向转化试验：注射无毒注射无毒IIR型，小鼠存活，检出型，小鼠存活，检出IIR型细菌型细菌注射有毒注射有毒IIIS型，小鼠死亡，检出型，小鼠死亡，检出IIIS型细菌型细菌注射注射65杀死的杀死的IIIS型，小鼠存活，无细菌检出型
3、，小鼠存活，无细菌检出注射无毒注射无毒IIR型型+65杀死的杀死的IIIS型，小鼠死亡，检出型，小鼠死亡，检出IIIS型细菌型细菌格里费斯由此推测，在格里费斯由此推测，在IIIS型的死菌体中必有一种转化因子型的死菌体中必有一种转化因子能使能使R型转化为型转化为IIIS型，而且这种转化可以遗传给后代。型，而且这种转化可以遗传给后代。1928年年Griffith的肺炎双球菌定向转化试验的肺炎双球菌定向转化试验 1944年，年，Avery和他的同事进一和他的同事进一 步从被高温杀步从被高温杀死的死的IIIS型菌中分离出蛋白质、荚膜的成分（粘多型菌中分离出蛋白质、荚膜的成分（粘多糖）和糖）和DNA，将
4、这几种成分分别同活的，将这几种成分分别同活的IIR型菌混型菌混合培养，发现只有合培养，发现只有DNA能使活的能使活的IIR型转化为型转化为IIIS型，型，即即:使无荚膜、不致病的肺炎双球菌转化为有荚膜、使无荚膜、不致病的肺炎双球菌转化为有荚膜、能致病的肺炎双球菌。能致病的肺炎双球菌。Avery的实验证明了的实验证明了Griffith所说的转化因子就是脱氧核糖核酸所说的转化因子就是脱氧核糖核酸(DNA)。Transformation(Avery,1944)确认确认DNA是遗传物质是遗传物质RNA也是遗传物质也是遗传物质 烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV
5、）Gierer&Schraman,1956结论：结论：核酸是遗传物质核酸是遗传物质主要作用：携带和传递遗传信息主要作用：携带和传递遗传信息一、核酸种类和分布一、核酸种类和分布DNA(deoxyribonucleic acid)细胞核，线粒体细胞核，线粒体(mtDNA)，叶绿体，叶绿体RNA(ribonucleic acid)细胞浆，细胞核细胞浆，细胞核研究内容研究内容基因、基因组的结构基因、基因组的结构遗传信息的复制、转录与翻译遗传信息的复制、转录与翻译核酸存储的信息修复与突变核酸存储的信息修复与突变基因表达调控和基因工程技术基因表达调控和基因工程技术 的发展和应用等的发展和应用等理论体系的核
6、心理论体系的核心遗传信息传递的中心法则（遗传信息传递的中心法则（central dogma）第二节第二节 核酸的结构核酸的结构一、一、DNA的结构的结构一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构DNA拓扑结构拓扑结构四级结构四级结构（一）（一）DNA的一级结构与种属差异的一级结构与种属差异DNA一级结构一级结构脱氧核苷酸的种类、数量及排列顺序脱氧核苷酸的种类、数量及排列顺序C值值(C value)：一个单倍体基因组中的全部一个单倍体基因组中的全部DNAC值矛盾（值矛盾（C Value paradox）生物基因组大小同生物在进化上所处地位的高低没有关系，生物基因组大小同生物在进化上所处地位
7、的高低没有关系，这种现象称为这种现象称为C值矛盾。值矛盾。不同生物种类基因组不同生物种类基因组DNA的的C值分布图值分布图DNA 测序测序Sanger法和法和Maxam-Gilbert法法生物芯片生物芯片Sanger法法酶促反应法（双脱氧法或末端终止法）酶促反应法（双脱氧法或末端终止法）Maxam-Gilbert法法化学裂解法化学裂解法1977年由年由Mamam和和Gilbert建立建立基因的基因的DNA链链各测序片段各测序片段5-端加放射标记端加放射标记带标记的带标记的DNA片段分成片段分成4份份限制性内切酶限制性内切酶若干可测序长度的若干可测序长度的DNA 片段片段基本原理基本原理经过不同
8、化学处理经过不同化学处理DNA链的某一种特定碱基处发生断裂链的某一种特定碱基处发生断裂一系列以该种碱基为末尾的不同长度的片段一系列以该种碱基为末尾的不同长度的片段四组片段经高分辨率凝胶电泳四组片段经高分辨率凝胶电泳放射自显影放射自显影分别针对分别针对 G；G+A T+C；C生物芯片技术生物芯片技术通过微加工技术和微电子技术在固相基质表面构建通过微加工技术和微电子技术在固相基质表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组的微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的的准确、快速、高通量准确、快速、高通
9、量的检测。的检测。基因芯片基因芯片（二）（二）DNA的二级结构的二级结构A-DNAB-DNAC-DNAD-DNAZ-DNA（左手螺旋）（左手螺旋）B-DNA仅仅仅仅是是DNA双螺旋构双螺旋构象中最为常见的一象中最为常见的一种。当外界条件发种。当外界条件发生改变时，双螺旋生改变时，双螺旋的构象也会改变。的构象也会改变。Z-DNA的结构特点：的结构特点：1.左旋左旋2.磷酸核糖骨架呈磷酸核糖骨架呈“之之”字形（字形（Zigzag）走向）走向3.糖苷键为顺式，核糖位于分子表面糖苷键为顺式，核糖位于分子表面4.分子外形呈波形分子外形呈波形5.大沟消失，小沟窄而深大沟消失，小沟窄而深6.每个螺旋有每个螺
10、旋有12bpZ-DNA存在的条件存在的条件1.高盐（高盐（NaCl2 mol/L,MgCl20.7 mol/L）2.嘌呤嘌呤-嘧啶（嘧啶（Pu-Py）相间排列）相间排列在活细胞中如果在活细胞中如果m5C,则无需则无需Pu-Py相间排列，在生相间排列，在生理盐水的浓度下即可产生理盐水的浓度下即可产生Z-DNA1.在体内多胺化合物（如精胺和亚胺及亚精胺）和在体内多胺化合物（如精胺和亚胺及亚精胺）和阳离子一样，可与磷酸基因结合，使阳离子一样，可与磷酸基因结合，使B-DNA转变成转变成 Z-DNA某些蛋白质（如某些蛋白质（如Z-DNA结合蛋白）带有正电荷，结合蛋白）带有正电荷，可使可使DNA周围形成局
11、部的高盐微环境周围形成局部的高盐微环境1.负超螺旋的存在负超螺旋的存在Z-DNA的生物学意义的生物学意义可能提供某些调节蛋白识别位点：啮齿类动物病毒可能提供某些调节蛋白识别位点：啮齿类动物病毒的复制起始部位有的复制起始部位有GC交替顺序的存在；在交替顺序的存在；在SV40的增的增强子中有三段强子中有三段8bp的的Z-DNA存在。存在。可能和转录有关：可能和转录有关：纤毛虫有大、小两个核，大核有纤毛虫有大、小两个核，大核有转录活性，小核与细胞繁殖有关。荧光标记转录活性，小核与细胞繁殖有关。荧光标记Z-DNA抗体仅和大核抗体仅和大核DNA结合，而不和小核的结合，而不和小核的DNA结合。结合。DNA
12、结构的研究手段结构的研究手段lX射线衍射技术射线衍射技术l扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜scanning tunneling microscopy,STM一种扫描探针显微术工具，可以观察和定位单一种扫描探针显微术工具，可以观察和定位单个原子，而且在低温下可以利用探针尖端精确个原子，而且在低温下可以利用探针尖端精确操纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量操纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量工具又是加工工具。是工具又是加工工具。是20世纪世纪80年代世界十大年代世界十大科技成就之一。科技成就之一。（三）（三）DNA的三级结构的三级结构DNA的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚的三级结构，是指在
13、一二结构基础上的多聚核苷酸链的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋核苷酸链的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲。基础上的卷曲。DNA三级结构包括三级结构包括超螺旋超螺旋、链的扭结链的扭结以及单链形以及单链形成的环或是环状成的环或是环状DNA中的中的连环体连环体。超超 螺螺 旋旋(supercoiled)负超螺旋负超螺旋正超螺旋正超螺旋原核生物原核生物DNA三级结构三级结构生物体闭环生物体闭环DNA都以都以超螺旋超螺旋形式存在，如细形式存在，如细菌质粒、病毒、线粒体菌质粒、病毒、线粒体DNA超螺旋的意义超螺旋的意义：紧密，体积更小；能影响双：紧密，体积更小；能影响双螺旋的解链程序，因而影响螺旋
14、的解链程序，因而影响DNA分子与其分子与其它分子之间的相互作用。它分子之间的相互作用。天然双链天然双链DNA构象构象-负超螺旋负超螺旋l基因活跃转录时，基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方聚合酶转录方向前方DNA的构象是正超螺旋，其后面的的构象是正超螺旋，其后面的DNA为负为负超螺旋。超螺旋。l正超螺旋会拆散核小体，有利于正超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶聚合酶向前移动转录；而负超螺旋则有利于核小体向前移动转录；而负超螺旋则有利于核小体的再形成。的再形成。三链三链DNA1957年由年由Felesnfeld及及Davis首先发现首先发现三链结构是由一条寡聚核苷酸通过与双链三链结构是由一
15、条寡聚核苷酸通过与双链DNA形成形成Hoogsteen键或反键或反Hoogsteen键，键，在在DNA双螺旋大沟处紧密缠绕而成。双螺旋大沟处紧密缠绕而成。与双螺旋相类似，三螺旋与双螺旋相类似，三螺旋DNA的组成结构的组成结构基本单位是基本单位是三联三联碱基体碱基体。基本类型：基本类型：Pu-Pu-Py型型在碱性介质中稳定在碱性介质中稳定 Py-Pu-Py型型在偏酸性介质中稳定在偏酸性介质中稳定l富含富含嘧啶嘧啶的的寡聚核苷酸寡聚核苷酸与双链与双链DNA的富含的富含嘌呤嘌呤的的单链以平行的方式键合，形成单链以平行的方式键合，形成Hoogsteen键；键；l富含富含嘌呤嘌呤的的寡聚核苷酸寡聚核苷酸
16、与双链与双链DNA的富含的富含嘌呤嘌呤的的单链以反平行的方式键合，形成反单链以反平行的方式键合，形成反Hoogsteen键。键。三链三链DNA既可以是既可以是B-DNA与另一条与另一条DNA链结合成的链间的三链链结合成的链间的三链DNA，又可以是，又可以是B-DNA与其自身的一条链结合形成的链与其自身的一条链结合形成的链内的三链内的三链DNA。要求双螺旋中存在连续的嘌呤或嘧啶序要求双螺旋中存在连续的嘌呤或嘧啶序列，而且必须是列，而且必须是镜像重复序列镜像重复序列。镜像重复序列镜像重复序列(mirror repeat)：由反方向完全相：由反方向完全相同的两个序列组成。同的两个序列组成。5 GGA
17、ATCGATCTT TTCTAGCTAAGG 33 CCTTAGCTAGAA AAGATCGATTCC 51987年，年，Mirkin等在一种酸性质粒中发现了等在一种酸性质粒中发现了一种三螺旋一种三螺旋DNA。三螺旋三螺旋DNA的应用：的应用：1.反基因战略反基因战略抗病毒抗病毒2.基因治疗基因治疗（四）（四）DNA的四级结构的四级结构DNA+蛋白质：螺线管、核糖体蛋白质：螺线管、核糖体二、二、RNA结构结构单链单链局部双螺旋局部双螺旋第三节第三节 核酸的功能核酸的功能一、一、DNA的功能的功能1.携带遗传信息：携带遗传信息：结构基因结构基因 调控基因调控基因2.催化作用催化作用脱氧核酶脱氧核
18、酶(Deoxyribozyme,DRz)Breaker RR,Joyce GF.A DNA enzyme that cleaves RNA.Chem Biol,1994,1:223-9.Cuenoud B,Szostak JW.A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.Nature,1995,375:611-4.到目前为止还未发现自然界中存在天然的到目前为止还未发现自然界中存在天然的Dz。运用体外分子进化技术，从人工合成的随机序列运用体外分子进化技术，从人工合成的随机序列DNA库中筛选出具有多种不同功能的库中筛选出具有多种不同功能的Dz，可满足不
19、同工作，可满足不同工作目的及工作条件需要：目的及工作条件需要：RNA剪切剪切RNA连接和修饰连接和修饰合成支链合成支链RNADNA剪切剪切DNA激酶激酶T4聚核苷酸激酶聚核苷酸激酶催化卟啉环金属螯合反应催化卟啉环金属螯合反应过氧化物酶过氧化物酶由于由于Dz的多样化功能，一方面使得的多样化功能，一方面使得Dz成为分子生成为分子生物学研究中的一种强有力的工具，另一方面也有物学研究中的一种强有力的工具，另一方面也有助于了解生命基础结构及其进化过程。同时助于了解生命基础结构及其进化过程。同时Dz已已广泛应用于病毒性疾病、肿瘤、遗传性疾病和血广泛应用于病毒性疾病、肿瘤、遗传性疾病和血管疾病的新型基因治疗
20、药物研究中。管疾病的新型基因治疗药物研究中。3.调节基因表达调节基因表达二、二、RNA功能功能（一）种类（一）种类mRNA,tRNA,rRNAsnRNA(small nuclear RNA)scRNA(small cytoplasmic RNA)siRNA (small interfering RNA)端粒酶端粒酶RNA 核酶核酶 (ribozyme)snRNA作用作用Pre-mRNAmRNA 16 kb 2.2kbRNA splicingscRNA：使分泌蛋白、膜蛋白定位合成于粗内质网使分泌蛋白、膜蛋白定位合成于粗内质网scRNA和相关蛋白质共同组成能够特异地识别、结合和相关蛋白质共同组成能
21、够特异地识别、结合信号肽的信号识别体信号肽的信号识别体(signal recognization particle,SRP)。SRP不仅识别信号肽并可与核糖体结合，暂时阻断多不仅识别信号肽并可与核糖体结合，暂时阻断多肽链的合成；肽链的合成；SRP还可与粗面内质网膜上的还可与粗面内质网膜上的SRP受体受体结合，介导核糖体和信号肽与膜上的核糖体结合蛋白结合，介导核糖体和信号肽与膜上的核糖体结合蛋白及蛋白通道结合，使核糖体定位于粗面内质网；随后及蛋白通道结合，使核糖体定位于粗面内质网；随后SRP与受体解离并进入新的循环；而信号肽引导继续与受体解离并进入新的循环；而信号肽引导继续合成的蛋白序列进入内质
22、网内腔。合成的蛋白序列进入内质网内腔。siRNA：一种快速关闭基因的途径：一种快速关闭基因的途径小干扰小干扰RNA(small interfering RAN,siRNA)可以高可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰干扰(RNA interference,RNAi,也译作也译作RNA干干预或干涉预或干涉)。RNAi是双链是双链RNA(dsRNA)通过与特异性互补链结合通过与特异性互补链结合从而抑制基因的表达，或者说是通过从而抑制基因的表达，或
23、者说是通过dsRNA引发转引发转录后基因沉默。录后基因沉默。基因沉默的意义：基因沉默的意义：细胞防御病毒的感染细胞防御病毒的感染调节正常基因的功能调节正常基因的功能siRNA技术与其它功能基因组研究方法相比较，具技术与其它功能基因组研究方法相比较，具有明显的优点：有明显的优点：1.比抗体易行比抗体易行2.小实验室也能完成小实验室也能完成3.比基因敲除实验周期更短比基因敲除实验周期更短4.可适应不同实验条件可适应不同实验条件5.比反义技术有更高的特异性和有效性比反义技术有更高的特异性和有效性6.能高通量地鉴定基因功能能高通量地鉴定基因功能端粒酶端粒酶RNA端粒端粒(Telomere)真核生物染色
24、体末端许多简单重复碱基序列和相关蛋白质组真核生物染色体末端许多简单重复碱基序列和相关蛋白质组成的复合结构。成的复合结构。人类端粒主要由人类端粒主要由5-TTAGGG-3片段重复串联组成，大约重片段重复串联组成，大约重复复2000次左右，长度范围为次左右，长度范围为2-15kb。端粒的功能是完成染色体末端的复制，防止染色体融合、重端粒的功能是完成染色体末端的复制，防止染色体融合、重组和降解。组和降解。端粒酶端粒酶(Telomerase)由单链由单链RNA和蛋白质构成的具有逆转录酶活性的核酸和蛋白质构成的具有逆转录酶活性的核酸-蛋蛋白质复合物。白质复合物。端粒酶是一种能延长真核细胞末端的逆转录酶，
25、在细胞衰端粒酶是一种能延长真核细胞末端的逆转录酶，在细胞衰老、永生化和癌变过程中发挥重要作用。老、永生化和癌变过程中发挥重要作用。端粒酶以自身端粒酶以自身RNA为模板，反转录合成端粒的重复序列并为模板，反转录合成端粒的重复序列并将其添加到正在复制的染色体端粒的将其添加到正在复制的染色体端粒的3-末端，以防止端粒末端，以防止端粒的缩短，从而实现端粒酶维持端粒长度的功能。的缩短，从而实现端粒酶维持端粒长度的功能。核酶核酶(ribozyme)具有酶活性的具有酶活性的RNA 分子，能结合特异分子，能结合特异RNA 分分子（靶子（靶RNA），在特定的位点切割底物），在特定的位点切割底物RNA 分子。分子
26、。根据结构，根据结构，RNA核酶主要分为：核酶主要分为：1.锤头状锤头状(hammerhead ribozyme)2.发夹状发夹状(hairpin ribozyme)3.假结样假结样（二）（二）RNA的功能的功能 参与蛋白质生物合成；参与蛋白质生物合成；贮存和传递遗传信息；贮存和传递遗传信息；作为结构物质；作为结构物质；调节基因表达；调节基因表达；催化作用等。催化作用等。三、基三、基 因因 功功 能能 的的 研研 究究 方法方法1.转基因动物转基因动物基因组中稳定地整合导入的外源基因组中稳定地整合导入的外源DNA，观察基因，观察基因表达功能和表型效应。表达功能和表型效应。2.基因敲除基因敲除利
27、用同源重组原理进行的基因打靶。利用同源重组原理进行的基因打靶。3.RNAi基因调控：关闭基因的表达，或改变基因表达的基因调控：关闭基因的表达，或改变基因表达的水平水平四、核酸与药物四、核酸与药物基因工程药基因工程药基因药物基因药物:基因治疗，基因疫苗基因治疗，基因疫苗1.反义核酸反义核酸(antisense nucleic acid)抗肿瘤，抗病毒抗肿瘤，抗病毒反义核酸是指能与特定反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断精确互补、特异阻断其翻译的其翻译的RNA或或DNA分子。分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术
28、即为反义核酸技术。达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。包括反义包括反义RNA、反义、反义DNA和核酶三大技术。和核酶三大技术。抑制翻译抑制翻译反义反义RNA一方面通过与靶一方面通过与靶mRNA结合形成空间位结合形成空间位阻效应，阻止核糖体与阻效应，阻止核糖体与mRNA结合，另一方面其结合，另一方面其与与mRNA结合后激活内源性结合后激活内源性RNase或核酶，降解或核酶，降解mRNA；抑制转录抑制转录反义反义DNA与基因与基因DNA双螺旋的调控区或编码区结双螺旋的调控区或编码区结合形成三链合形成三链DNA，终止正在转录的，终止正在转录的mRNA链延长。链延长。此外，反义核酸还可抑制此外，反义
29、核酸还可抑制mRNA的的转录后转录后加工加工（如（如5端加帽、端加帽、3端加尾端加尾(poly a)、中间剪接和内部、中间剪接和内部碱基甲基化等）并阻止成熟碱基甲基化等）并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞由细胞核向细胞浆内运输。浆内运输。福米韦生福米韦生(fomivirsen，ISIS2922)是是FDA批准上市的第批准上市的第1个反义药物个反义药物由由21个硫代脱氧核苷酸组成，核苷酸序列为个硫代脱氧核苷酸组成，核苷酸序列为5-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3主要用于艾滋病并发的巨细胞病毒主要用于艾滋病并发的巨细胞病毒(CMV)性性视网膜炎的治疗视网膜炎的治疗 2.核核 酶酶 的的
30、 应应 用用基因治疗基因治疗抗抗HIV抗肝炎病毒抗肝炎病毒 抗肿瘤抗肿瘤 抗移植排斥反应抗移植排斥反应抗白血病抗白血病3.基因组药物基因组药物进入临床的基因组药物进入临床的基因组药物髓样造血细胞抑制因子髓样造血细胞抑制因子-1（MPIF-1）角质细胞生长因子角质细胞生长因子-2（KGF-2）血管内皮细胞生长因子血管内皮细胞生长因子-2（VEGF-2）第四节第四节 核酸的变性、复性和杂交核酸的变性、复性和杂交一、核酸变性一、核酸变性(denaturation)指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但不涉指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但不涉及共价键（及共价键（3,5-,5-磷酸二酯键）磷酸二酯
31、键）的断裂。的断裂。核酸的变性可发生在整个核酸的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生分子中，也可发生在局部的双螺旋节段上（局部变性）。在局部的双螺旋节段上（局部变性）。核酸变性过程中，其物理和化学性质发生一核酸变性过程中，其物理和化学性质发生一系列变化，包括系列变化，包括:紫外吸收值增加，紫外吸收值增加，粘度下降，粘度下降，沉降系数增加，沉降系数增加，比旋度降低，比旋度降低，生物活性丧失，生物活性丧失，细菌细菌DNA失去转化能力，等失去转化能力，等热变性热变性(thermal denaturation)DNA溶液加热到溶液加热到80左右，双螺旋结构受左右，双螺旋结构受到破坏，氢键断裂，两条连
32、彼此分开形成到破坏，氢键断裂，两条连彼此分开形成无规则线团。无规则线团。解链温度解链温度(melting temperature,Tm)在热变性过程中，通常将增色效应达到一在热变性过程中，通常将增色效应达到一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为变半时即双螺旋被解开一半时的温度称为变性温度或解链温度性温度或解链温度影响影响Tm值的因素值的因素1.DNA碱基组成碱基组成 G+C含量越多，含量越多，Tm值越高值越高；反之，反之，A+T含量越多，含量越多，Tm值越低值越低 在标准条件下在标准条件下(即即0.15mol/LNaCl-0.015mol/L柠檬柠檬酸钠酸钠)，当，当G+C的含量上升的含量上升1
33、%，则，则Tm上升上升0.4。马默多蒂（马默多蒂（Marmur-Doty）关系式）关系式：Tm=69.3+0.41(G+C)%DNA的均一性的均一性 DNA组成越均一组成越均一（如多聚如多聚A-T或多聚或多聚G-C），其，其变性过程同步性越好变性过程同步性越好，Tm范围较窄；反之，非范围较窄；反之，非均一性均一性 DNA分子，分子，Tm范围较宽。范围较宽。3.溶液离子强度溶液离子强度同一种同一种DNA分子在不同离子强度溶液中其分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同。值不同。低离子强度，低离子强度，Tm值低，解链温度范围宽；值低，解链温度范围宽；高离子强度，高离子强度，Tm值高，解链温度范围窄。值
34、高，解链温度范围窄。4.pH值值核酸溶液的核酸溶液的PH值在值在5-9范围内，范围内，Tm值变化不明显。值变化不明显。pH11，碱基，碱基N原子去质子化，不利于氢原子去质子化，不利于氢键的形成。键的形成。5.变性剂变性剂各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低而降低Tm值。如尿素，甲醛。值。如尿素，甲醛。二、核酸的复性二、核酸的复性(renaturation)变性的变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重新的形两条互补单链，在适当条件下重新的形成双链的过程称为成双链的过程称为DNA复性或退火复性或退火(annealing)。DNA复性后，理化性
35、质和部分生物活性恢复。复性后，理化性质和部分生物活性恢复。复性过程并不是变性反应的简单逆过程，变性过程可以在复性过程并不是变性反应的简单逆过程，变性过程可以在一个很短时间内完成，而复性则需要相对较长时间才能完成一个很短时间内完成，而复性则需要相对较长时间才能完成影响影响DNA复性的速度复性的速度1.DNA大小大小2.离子强度离子强度增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度度3.DNA浓度浓度浓度越大，复性速度加快。浓度越大，复性速度加快。一般以一般以Cot来表示复性速度来表示复性速度C0是变性是变性DNA的起始浓度，以每升溶液中核苷酸的摩的起始浓度，以
36、每升溶液中核苷酸的摩尔数来表示，尔数来表示，t是在二级反应中保温时间，以秒计。是在二级反应中保温时间，以秒计。单位单位mols/L。DNA分子信息量越大，复性所需的时间越长。分子信息量越大，复性所需的时间越长。三、核酸杂交三、核酸杂交(hydridization)与应用与应用 变性的变性的DNA在一定条件下重新缔合不仅可在在一定条件下重新缔合不仅可在同源的两条互补键之间进行同源的两条互补键之间进行应用应用 定量或定性计算特定基因的频率、基因组的定量或定性计算特定基因的频率、基因组的特点和组成、基因表达和定位等特点和组成、基因表达和定位等1.核酸探针（核酸探针（probe）指能与特定核苷酸序列发
37、生特异互补杂交，杂交后指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。应用：应用：克隆筛选、基因点突变分析以及某些临床诊断等克隆筛选、基因点突变分析以及某些临床诊断等探针的种类探针的种类cDNA探针、基因组探针、基因组DNA探针、探针、RNcDNA探针、人工合成寡核苷酸探针探针、人工合成寡核苷酸探针探针的标记探针的标记放射性同位素标记：常用放射性同位素标记：常用32P、3H、35S，也有用，也有用131I、125I和和14C优点：检测特异性高，灵敏度极高，可检测优点：检测特异性高，灵敏度极高，可检测到到10-141
38、0-18g的物质的物质缺点：易造成放射性污染缺点：易造成放射性污染非放射性标记非放射性标记生物素、酶、荧光素、化学发光标记物等等。生物素、酶、荧光素、化学发光标记物等等。2.核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术液相分子杂交液相分子杂交固相分子杂交固相分子杂交固相分子杂交固相分子杂交原理原理 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。优点优点 通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在通过漂洗能将未杂交的
39、游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自的自我复性我复性支持物种类支持物种类 硝酸纤维素膜、尼龙膜、磁珠、微孔板等硝酸纤维素膜、尼龙膜、磁珠、微孔板等常用固相杂交类型常用固相杂交类型Southern印迹印迹Northern印迹印迹斑点杂交斑点杂交菌落杂交菌落杂交原位杂交原位杂交各种核酸杂交方法的适用范围各种核酸杂交方法的适用范围杂交方法杂交方法适用范围适用范围Southern 印迹印迹(Southern blot)检测检测DNANorthern印迹印迹(Northern blot)检测检测RNA斑点杂交斑点杂交(dot-blot hybr
40、idization)检测未经分离的，固定在膜上检测未经分离的，固定在膜上DNA或或RNA菌落杂交菌落杂交(Colony in situ hybridization)检测固定在膜上，经裂解后从细菌体释检测固定在膜上，经裂解后从细菌体释放的放的DNA原位杂交原位杂交(in situ hybridization)检测细胞或组织中的检测细胞或组织中的DNA或或RNA第五节第五节 病毒核酸病毒核酸（一）病毒的基本概念（一）病毒的基本概念1.病毒结构特点：病毒结构特点：无细胞结构无细胞结构一种核酸（一种核酸（DNA或或RNA）及蛋白质）及蛋白质依靠自身的核酸进行复制，依靠自身的核酸进行复制，缺乏完整的缺乏
41、完整的 酶和能酶和能 量系统量系统专性寄生性专性寄生性，必须在活细胞中才能增殖，必须在活细胞中才能增殖病毒的定义病毒的定义病毒是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我病毒是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。2.分类分类动物、植物病毒：动物、植物病毒：流感病毒、流感病毒、疱疹病毒、小麦丛矮病毒、昆虫病毒疱疹病毒、小麦丛矮病毒、昆虫病毒细菌病毒：细菌病毒：噬菌体噬菌体bacteriophage，简称，简称phage拟病毒拟病毒朊病毒朊病毒（二）病毒核酸的一般特征（二）病毒核酸的一般特征遗传物质：病毒遗传和感染的物质基础遗传物质
42、：病毒遗传和感染的物质基础除逆转录病毒基因组为二倍体外，其它病毒除逆转录病毒基因组为二倍体外，其它病毒的基因组都为单倍体。的基因组都为单倍体。病毒的核酸病毒的核酸双链环状双链环状DNA(dsDNA)乙肝病毒乙肝病毒双链线状双链线状DNA 腺病毒腺病毒单链单链RNA(ssRNA)脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒单链单链DNA(ssDNA)双链双链RNA(dsRNA)病毒基因结构特点：病毒基因结构特点：1.基因组很小，基因数少，所含的遗传信息基因组很小，基因数少，所含的遗传信息也相应少，依赖宿主细胞的许多功能来进也相应少，依赖宿主细胞的许多功能来进行复制。行复制。2.有重叠基因存在。即在同一端可以编码
43、有重叠基因存在。即在同一端可以编码2-3种蛋白质分子。这种结构可使较小的基因种蛋白质分子。这种结构可使较小的基因组携带更多的遗传信息组携带更多的遗传信息3.噬菌体的基因是连续的，基因组中无内含子。噬菌体的基因是连续的，基因组中无内含子。但感染真核细胞的病毒基因是不连续的，具但感染真核细胞的病毒基因是不连续的，具有内含子。有内含子。4.病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有一小部分不被翻译，不翻译的只有一小部分不被翻译，不翻译的DNA序序列包括基因之间的间隔区和基因表达的调控列包括基因之间的间隔区和基因表达的调控序列。序列。5.病毒基因组病毒基因组DNA序列中功能相关的蛋白质基序列中功能相关的蛋白质基因或因或rRNA基因常集中在基因组的一个或几基因常集中在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。元。6.除反转录病毒基因组有两个拷贝外，其它病除反转录病毒基因组有两个拷贝外，其它病毒基因组都是单倍体，在病毒颗粒中每个基毒基因组都是单倍体，在病毒颗粒中每个基因只有一个拷贝。因只有一个拷贝。
