1、1第三节基因工程中的酶学第三节基因工程中的酶学了解各种酶在基因工程了解各种酶在基因工程中的作用中的作用掌握限制性内切酶和连掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性接酶的基本特性逆转录酶在基因工程中逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？参与了哪些反应？23重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I反转录酶多聚核苷酸激酶末端转移酶碱性磷酸酶识别特异序列，切割DNA催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，是DNA切口封合或是DNA片段连接合成双链cDNA的第二条链缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端合成cDNA代替DNA聚合酶I进行填补，标记
2、或DNA序列分析催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针在3羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基4第一第一 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割特定核苷酸序列，并由此切割DNADNA双链结双链结构的核苷酸内切酶。构的核苷酸内切酶。5一、限制性内切酶概念的提出一、限制性内切酶概念的提出寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction）与修饰）与修饰 (modification)(modificati
3、on)现象：现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（制与修饰现象简称（R/MR/M体系）。体系）。细菌的细菌的R/MR/M体系类似于免疫系统，能体系类似于免疫系统，能辨别自身的辨别自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA，并能使后，并能使后者降解掉。者降解掉。6 为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的DNA呢？7R/MR/M体系：体系：寄主是由两种酶活性配合完成的寄主是由两种酶活性配合完成的 一一种是修饰的甲基转移酶种是修饰的甲基转移酶 另另一种是核酸内切限制
4、酶一种是核酸内切限制酶8 E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶核酸酶和和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 以以(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.E.colicoliB B为例为例9限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNADNA切成小片断。切成小片断。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction）10细菌自身的细菌自身的DNADNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。酶识别切割。（2 2）修饰（）修饰（ModificationModi
5、fication）DamDam甲基化酶甲基化酶G GA ATC TC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基 DcmDcm甲基化酶甲基化酶C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列在第二个C C上上C C5 5位置上引入甲基位置上引入甲基1112 R/MR/M体系的作用：体系的作用：保护自身的保护自身的DNADNA不受限制；不受限制；破坏外源破坏外源DNADNA使之迅速降解使之迅速降解13切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。14I I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的
6、限制性内切酶。的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型II II 类限制性内切酶类限制性内切酶 IIIIII类限制性内切酶类限制性内切酶 不适用于基因工程。只在肠道菌不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。中发现。基因工程的工具酶基因工程的工具酶 切割位点不在识别位点，一般离识别位点切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp27bp，对分子克隆操作亦无实用意义对分子克隆操作亦无实用意义 15首先由首先由H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在在19701970年从流感嗜血菌中分离出来。年从流感嗜血菌中分离出来。（1 1）识别位点序列）
7、识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNADNA上的特殊靶序上的特殊靶序列（多数是回文序列）。列（多数是回文序列）。II II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind Hind 16（2 2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNADNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky sticky endend）或）或平齐末端平齐末端（blunt endblunt end）。）。识别位点处。识别位点处。17（3 3）平末端（）平末端（blunt endblunt end）两条链上的断裂位置是处在一两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心个对称结构的中心,
8、这样形式的这样形式的断裂是形成具有平末端的断裂是形成具有平末端的DNADNA片断。不易重新环化。片断。不易重新环化。18l两条链上的断裂位置是交错两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的断裂结构中心，这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的结果形成具有粘性末端的DNADNA片段片段（4 4）粘性末端（）粘性末端（sticky endssticky ends，cohensive endscohensive ends）19含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型：5 5端凸出（如端凸出（如EcoR IEcoR I切点
9、）切点）G GAATTCAATTC CTTAACTTAA G G G G AATTCAATTC CTTAACTTAAG G5-5-3-3 3-3-5-5 5-5-3-3 3-3-5-5 3-3-55-20CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如Pst I切点）切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 5-3-21与DNA结合的限制性内切酶BamH 1的结构。限制性内切酶识别双链DNA序列5-GGATCC-3，并在两个GG残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有5粘性末端的DNA片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。22 连接便利连接便利 （5
10、5）粘性末端的意义）粘性末端的意义i i）不同的）不同的DNADNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii ii）同一个）同一个DNADNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接通过两个相同的粘性末端可以连接成成环形分子环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。2324 补平成平齐末端补平成平齐末端 55末端标记末端标记凸出的凸出的55末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激多核苷酸激酶进行酶进行3232P P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶补平成平齐聚合酶补平成平齐末端。末端。25l
11、同位酶是具有相同的识别序列，同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶但酶切位点不同的酶 如Sma I和Xma I的识别序列为 5-CCCGGG-3,但酶切位点不同。Sma I 5-CCCGGG-3,Xma I 5-CCCGGG-3,同位酶同位酶26同裂酶（同裂酶（IsoschizomersIsoschizomers）l 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端裂酶产生同样的切割，形成同样的末端 l Example:Example:限制酶限制酶HpaHp
12、a和和MspMsp是一对同裂酶是一对同裂酶 (CCGG)(CCGG)，5 C.CGG 3 3 GGC.C 3 27同尾酶（同尾酶（IsocaudamerIsocaudamer）l这一类的这一类的限制限制酶来源各异，识别的靶酶来源各异，识别的靶序列序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的尾酶产生的DNADNA片段，是能够通过其粘片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的性末端之间的互补作用彼此连接起来的BamHBamH G G GATC GATC C Bcl TC Bcl T GATCGATC A A C C CTAGCTAG G AG
13、A CTAGCTAG T T 28从细菌从细菌DNADNA环化现象推测，必定存在一环化现象推测，必定存在一种能把两条种能把两条DNADNA双链连接到一起的酶。双链连接到一起的酶。第二第二 DNA DNA 连接酶连接酶一、一、DNADNA连接酶（连接酶（ligase)ligase)的发现的发现DNADNA复制一定有断口。复制一定有断口。基因的“针线”29DNADNA连接酶连接酶 在一条在一条DNADNA链的链的33末端具有一个游离末端具有一个游离的羟基（的羟基（-OH-OH），和在另一条），和在另一条DNADNA链的链的5-5-末端具有一个磷酸基团（末端具有一个磷酸基团（-P-P）的情）的情况下
14、，能够催化在两条况下，能够催化在两条DNADNA链之间形成链之间形成的磷酸二酯键的磷酸二酯键 30（1 1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1.1.两种两种DNADNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端。粘性末端。二、二、DNA ligaseDNA ligase的特点的特点（2 2）T4T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，不但能连接粘性末端，还能连接还能连接齐平末端齐平末端。31（1 1）必须是两条）必须是两条双链双链DNADNA或或DNA-RNADNA-RNA。（2 2）DNA3DNA3端有游离的端有游离的-OH-OH，55端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P P）。）。（
15、3 3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中：NADNAD+2.2.连接条件连接条件323.DNA3.DNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质33DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质34连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是3737 C C。三、连接反应的温度三、连接反应的温度1.1.最佳温度最佳温度但在但在3737下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2.2.实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 416 C C。35第三第三 DNADNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNADNA聚
16、合酶聚合酶1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 2.Klenow fragment2.Klenow fragment 3.T7 DNA3.T7 DNA聚合酶聚合酶 4.T4 DNA4.T4 DNA聚合酶聚合酶 5.5.修饰过的修饰过的T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶 6.6.逆转录酶逆转录酶36二、二、DNADNA聚合酶在基因工程中的用途聚合酶在基因工程中的用途1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。37大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I 的基本用途的基本用途5
17、3的DNA聚合酶活性38用枯草杆菌蛋白用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌酶处理大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶 I I可以可以切掉切掉NN端的端的部部分。就成为分。就成为Klenow fragmentKlenow fragment。具有具有5533聚合酶活性和聚合酶活性和3355外切酶活性。（外切酶活性。（失失去了去了5533外切酶活性外切酶活性）。）。（1 1）Klenow fragmentKlenow fragment的性质的性质39 3 3端补平端补平补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的33隐蔽端隐蔽端。（2 2）主要用途）主要用途3340在在33隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加
18、上放射性标记的dNTPdNTP。413.3.逆转录酶逆转录酶最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母鸟类骨髓母细胞瘤病毒细胞瘤病毒（a avian vian mmyeloblastosis yeloblastosis v virus,irus,AMVAMV）：）：依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶（聚合酶（RNARNA指指导的导的DNADNA聚合酶）。聚合酶）。来源来源RNARNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。42逆转录酶的用途逆转录酶的用途以以oligo dToligo dT为引物（与为引物（与mRNAmRNA的的polyApolyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。4344第四第四1
19、.1.碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。B Bacterial acterial a alkaline lkaline p phosphatasehosphatase，BAPBAP（1 1）细菌性碱性磷酸酶）细菌性碱性磷酸酶（2 2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶C Calf alf i intestinal alkaline ntestinal alkaline p phosphatasehosphatase，CIPCIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。具有抗热性。SDSSDS中加热中加热6868o oC C可完全失活。可完全失活
20、。45l其用途是：其用途是：除去除去 DNA DNA 片段的片段的 5-5-磷酸，以磷酸，以防止自身环防止自身环化。化。46、T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.1.来源来源从从T4T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。2.2.功能功能催化催化 磷酸从磷酸从ATPATP转给双链或单链转给双链或单链DNADNA或或RNARNA的的5-OH5-OH端。端。不论不论5-OH5-OH端突出与否。端突出与否。47l该酶的用途是：该酶的用途是：为化学测序法标记为化学测序法标记 DNA DNA 的的 5 5 末端；末端；48小结小结1.限制性内切酶：切割2.DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。3.DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。
