1、实验注意事项及影响试验结果的因素分析 一、实验注意事项二、影响试验结果的因素分析三、企业产品优势 一、试验操作注意事项 2019年版中国药品检验标准操作规程P297细菌内毒素检查法 实验前，须用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液。复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1-3秒，促进鲎试剂的溶解。由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支细菌内毒素标准品。在进
2、行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。二、试验误差分析及改进措施l鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 l细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响l实验器皿的的影响l样品成份及理化性质的影响l实验员的影响 l环境的影响 1 1、鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响、鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；鲎试剂灵敏度标示值的准确性。1）、鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌
3、内毒素国家标准品标定？标示值是否准确？不同厂家的鲎试剂虽然标示值（）相同，但仍然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，有的真实灵敏度可能是0.65EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂可能是0.30EU/ml时，按0.5-2误差标准都是合格产品，但对同一检品在相同的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。我本公司对鲎试剂质量得控制：原料；工艺用水；生产环节；灵敏度标定。标示灵敏度国家标准企业标准0.50EU/ml0.26EU/ml0.50EU/ml0.42EU/ml0.50EU/ml0.25EU/ml0.126EU/ml0.25EU/ml0.21EU/ml0.2
4、5EU/ml 鲎试剂的活性只能控制在某一个范围内，不可能控制在一个点，我们要求允许波动的范围尽可能的小减少批间误差。2、细菌内毒素标准品引起的误差l细菌内毒素标准品种类l细菌内毒素标准品效价误差l细菌内毒素标准品操作误差l细菌内毒素单位表示误差 l细菌内毒素标准品的错误使用 1）、细菌内毒素标准品种类细菌内毒素国际标准品细菌内毒素国家标准品细菌内毒素工作标准品 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。2019
5、年版中国药典2）、细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可能存在一定的误差。中国药典要求“当c在0.5-2(包括0.5和2)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。3）、内毒素标准品操作误差 取细菌内毒素工作标准一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。正确正确（易折点）错误（易折点）错误注意：只能在
6、安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素工作标准品。若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用。4）、错误使用 有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。3、实验器皿的影响l器皿的计量管理（校正）l器皿的选择标准l器皿的正确处理1）、器皿的选择标准 鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光滑；易于清理。细菌内毒素检查实验
7、不宜选用注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在此行业中被鉴定为无内毒素和-葡聚糖污染的产品，其中包括,无热原试管、无热原移液器吸头。这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快分析判断出误差原因。2）、器皿的正确处理2019年版中国药品检验标准操作规范278页细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液
8、中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用多效蒸馏水冲洗鲎
9、试验用玻璃器皿。移液管浸泡洗液时，应如何放置？移液管浸泡洗液时，应如何放置？A、正 B、反反放（尖端向上）的优点？反放（尖端向上）的优点？1、保护移液管刻度的准确性；2、防止标本缸底部结晶体堵塞移液管。4 4、样品成份及理化性质的影响、样品成份及理化性质的影响 l-葡聚糖样物质的影响lPH值的影响l金属离子和弱酸阴离子的影响l药物浓度的影响 1 1）、）、-葡聚糖样物质的影响常见现象：假阳性。鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和
10、-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其它物质（如-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。鲎试剂反应机理图判断假阳性的方法：1、特异性鲎试剂法；2、定量反应曲线分析法；3、家兔模拟试验法。假阳性事件：1、2019年山东省青州某制药厂，5%葡萄糖注射液（规格：100ml 产品批号：0307040101）；2、2019年广东省湛江某制药公司，Vc注射液（产品批号：）；3、2019年上海市某制药公司，塑瓶装5%葡萄糖注射液（产品批号：0501142）；2 2）、）、PHPH值对反应速度的影响值对
11、反应速度的影响常见现象：样品阳性不成立。鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10时，酶活性受到抑制。相对活力PH7.0PH对反应速度的影响:u影响酶原的激活；u影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使其变性失活。故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.5-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典故2019版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。成功案例：1、头孢吡肟2、盐酸土霉素、土霉素3、喹诺酮类输液4、血液保存液、红细胞保存液3 3）、金属离子和弱酸阴离
12、子）、金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。成功案例：1、碳酸氢钠注射液2、乙肝疫苗3、注射用果糖二磷酸钠4 4）、药物浓度）、药物浓度1、10%葡萄糖注射液2、白蛋白、小牛血清3、医
13、用透明质酸钠4、中药类注射液 5、实验员的影响操作时严格按操作规程进行，安瓿开启前应先用酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加样时，取样均应准确。如果一人独立完成试验，可先稀释配制好内毒素标准溶液和样品溶液，然后开启复溶鲎试剂，最后加样，尽可能缩短鲎试剂溶液暴露在空气中的时间（最好控制在15分钟内）。6、环境的影响l保温时间l保温温度1）、保温温度 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49保
14、温90min也未出现凝胶。从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在2541之间，随着温度的升高，反应速度也升高，41尚未达到反应速度峰值，25 时反应速度已相当快；在4146之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到49或更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性，则鲎试剂被破坏，反应速度反而降低。2）、保温时间 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2，进行鲎试验，37保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶的形成状态随着时间的延长而坚固。因此夏天室温较高，如果试验操作时间太长，细菌内毒素与鲎试剂混合液不等进入反应仪器反应已开始，实际反应时
15、间超过1小时。由于室温不同，冬夏季节、南北地区之间的操作误差将会很大。即使在25准室温下操作，操作时间拖得过长，细菌内毒素含量较高时，测定误差也不会小。三、企业产品优势 1、能准确判断假阳性 用本企业研制生产的定量鲎试剂第一家准确无误地检测出了内毒素与葡聚糖二者之间的区别，并公布了内毒素与非内毒素反应曲线。截止目前，还没有第二个品牌的鲎试剂将假阳性区别出来，其他国内外研究机构也未公布同类型曲线。对于假阳性的鉴别已经远远走在了世界同行业的前面。2、对外交流历史悠久，全面掌握中美两国鲎试剂的区别1）对外交流我公司历史最悠久、交流技术最全面；2）我公司掌握了中国和美国鲎试剂的全面区别；3）用美国和中
16、国的内毒素标准品，我公司鲎试剂标示灵敏度都相当准确。4）通过十多年的技术交流结果显示，本公司的鲎试剂与美国同类产品质量相比没有任何差别，而且个别项目要优于美国产品。三、售后技术服务专业，技术优势明显 细菌内毒素检查法在我国已开展了十多年，经过许许多多专家学者的努力，目前该行业已经取得了非常重要的成果，但是该领域仍然有许多我们无法解决问题的存在，它并不想我们想象的那么简单，这些问题的存在严重阻碍了该行业的进一步发展，我们将与客户的交流以及客户咨询的相关问题，进行一次归纳总结。通过工作中出现的问题有必要对以下情况进行交流，以加强对细菌内毒素检查法的正确理解，同时纠正一些错误的观念。如何全面理解细菌
17、内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？如何正确认识器皿洗涤的重要性？如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。解决这些问题需要非常丰富的专业知识，我们公司在专业知识方面具有得天独厚的优势，其他鲎试剂生产企业望尘莫及。下面我们将客户遇到的困难，其他鲎试剂生产企业无法解决的技术问题，最终由我们帮助解决了的案例列举如下：1、输液塑瓶溶出物聚丙烯添加剂假阳性反应鉴别方法；2、盐酸土霉素细菌内毒素定量分析回收率偏低的技术问题；3、阳性对照为阴性结果的问题；4、头孢类抗生素细菌内毒素检测假阳性问题；5、乙肝疫苗细菌内毒素检测样品阳性对照为阴性问题。通过解决以上技术问题，我们展示了企业的技术实力，加强了与客户之间的沟通，赢得了客户的信任，赢得了市场。
