1、食品中氨基酸和蛋白质的测食品中氨基酸和蛋白质的测定定第十章第十章 食品中氨基酸和食品中氨基酸和蛋白质的测定蛋白质的测定一、一、氨基酸的测定氨基酸的测定二、蛋白质的测定二、蛋白质的测定 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸2020种。种。其中必需氨基酸其中必需氨基酸8 8种种:亮氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。氨酸和缬氨酸。一、一、氨基酸的测定氨基酸的测定（一）概述（一）概述氨基酸态氨基酸态氮的测定氮的
2、测定甲醛滴定法甲醛滴定法电位滴定法电位滴定法氨基酸总氨基酸总量的测定量的测定茚三酮比色法茚三酮比色法氨基酸类氨基酸类型和含量型和含量的测定的测定氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪（二）食品中氨基酸态氮的测定（二）食品中氨基酸态氮的测定 原理：原理：氨基酸为两性电解质，既含有酸性的氨基酸为两性电解质，既含有酸性的羧基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水羧基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子形成内盐，当溶液中，全部解离为双极离子形成内盐，当加入甲醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱加入甲醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱性消失，游离出酸性的羧基，这样就可以用性消失，游离出酸性的羧基
3、，这样就可以用标准碱溶液来滴定羧基，根据消耗的碱标准标准碱溶液来滴定羧基，根据消耗的碱标准溶液的体积即可计算出氨基酸态氮。溶液的体积即可计算出氨基酸态氮。1.1.甲醛滴定法甲醛滴定法l甲醛反甲醛反应应lRlCHlNH3+lCOOlHCHOlRlCHlNHCH2OHlHCHOlRlCHlN(CH2OH)2l羟甲基氨基酸羟甲基氨基酸l二羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸lCOOlCOOH+（1）40%中性甲醛中性甲醛（2）1%酚酞指示剂酚酞指示剂（3）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准溶液（4）活性碳）活性碳 试剂试剂仪器仪器（1 1）样品处理：）样品处理：l对于含水量少的固体样品粉碎过筛，混匀
4、，称样对于含水量少的固体样品粉碎过筛，混匀，称样 l含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成匀浆，称匀浆匀浆，称匀浆 l液体样品：直接吸取液体样品：直接吸取l将样品置于小烧杯中，加蒸馏水将样品置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭，活性炭5g，加热煮沸加热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，用过滤，用40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液备用。备用。测定步骤测定步骤n（2）测定）测定n在上述滤液中加入在上述滤液中加
5、入3-4滴酚酞指示剂，滴酚酞指示剂，用用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，而后加入中性甲醛红色，而后加入中性甲醛20mL，摇匀，浅红，摇匀，浅红色消失色消失（为什么？）。为什么？）。继续用继续用0.1mol/L氢氧氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，记录自记录自甲醛加入后所消耗的甲醛加入后所消耗的0.1mol/L氢氧化钠标准氢氧化钠标准溶液的体积。溶液的体积。n n（3）做空白实验）做空白实验式中：式中：C-氢氧化钠标准溶液的浓度（氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）V-样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（样品溶液
6、消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL）V0-空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）m-样品的质量（样品的质量（g）0.014-氮的毫摩尔质量（氮的毫摩尔质量（g/mmol）结果计算结果计算1.1.该方法简便、易行，适用于测定食品中该方法简便、易行，适用于测定食品中的游离氨基酸态氮。的游离氨基酸态氮。2.2.若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。后再测定，或用电位滴定法进行测定。说明及注意事项说明及注意事项2.2.电位滴定法电位滴定法 原理：原理：氨基酸为两性电解质，既含有羧氨基酸为两性电解质，既含有羧基又含
7、有氨基，加入甲醛后，甲醛与氨基又含有氨基，加入甲醛后，甲醛与氨基酸的氨基作用，使羧基显示出酸性，基酸的氨基作用，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液进行滴定，以酸度用氢氧化钠标准溶液进行滴定，以酸度计测定终点计测定终点pH=9.2 。v酸度计酸度计酸度计酸度计磁力搅拌器磁力搅拌器仪器仪器n（1）40中性甲醛溶液中性甲醛溶液n（2）0.05mol/L NaOH标准溶液标准溶液n 试剂试剂 吸取含氨基酸的样品溶液吸取含氨基酸的样品溶液5-10mL于于100mL容量瓶中，容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取加水至刻度，混匀后吸取20mL置于置于200mL烧杯中，烧杯中，加水加水60mL，插入酸度计的指示
8、电极和参比电极，开，插入酸度计的指示电极和参比电极，开动磁力搅拌器，用动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至酸标准溶液滴定至酸度计指示度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数，供计算总酸含量。供计算总酸含量。向上述溶液中加入向上述溶液中加入10mL 40%中性甲醛溶液，混匀。中性甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准溶液继续滴定至再用氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录自加，记录自加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。测定步骤测定步骤（1 1）样品处理）样品处理同甲醛滴定法同甲醛滴定法（2 2）样液
9、测定）样液测定l（3）做空白实验）做空白实验式中：式中：C-氢氧化钠标准溶液的浓度（氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）V-样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL）V0-空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）m-样品的质量（样品的质量（g）0.014-氮的毫摩尔质量（氮的毫摩尔质量（g/mmol）结果计算结果计算1.1.此法适用于测定各类食品中的游离氨此法适用于测定各类食品中的游离氨基酸。基酸。2.2.操作简便，结果准确性高。操作简便，结果准确性高。说明及注意事项说明及注意事项（二）（二）氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定 -茚三
10、酮比色法茚三酮比色法 l氨基酸在碱性溶液中与水合茚三酮作用，生氨基酸在碱性溶液中与水合茚三酮作用，生成蓝紫色化合物，其颜色深浅在一定范围内成蓝紫色化合物，其颜色深浅在一定范围内与氨基酸含量成正比，在波长与氨基酸含量成正比，在波长570nm下比色，下比色，测定吸光度。测定吸光度。l脯氨酸与水合茚三酮作用生成黄色化合物，脯氨酸与水合茚三酮作用生成黄色化合物，需在波长需在波长440nm下比色。下比色。原理原理l还原还原茚三酮茚三酮l水合茚三酮水合茚三酮l蓝紫色物质蓝紫色物质（1）2%茚三酮溶液茚三酮溶液:茚三酮茚三酮+SnCl2试剂试剂n（2）pH 8.04磷酸缓冲液磷酸缓冲液（3）氨基酸标准溶液）
11、氨基酸标准溶液:亮氨酸亮氨酸v1.1.制作甘露糖标准曲线：制作甘露糖标准曲线：v（1 1）绘制标准曲）绘制标准曲线线v测定步骤测定步骤试管管号试管管号 0123456氨基酸标准液氨基酸标准液（200g/mL）0123456氨基酸含量氨基酸含量（g）020040060080010001200加蒸馏水加蒸馏水（mL）8765432pH 8.04磷酸缓磷酸缓冲液（冲液（mL）22222222%茚三酮溶茚三酮溶液（液（mL）2222222 混匀，置于沸水浴中加热混匀，置于沸水浴中加热15min，冷却后，冷却后，用水定容至用水定容至50mL，静置，静置15min后，在波后，在波长长570nm下比色，测定
12、吸光度。以氨基下比色，测定吸光度。以氨基酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。绘制标准曲线。l含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取l含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成匀浆，称匀浆捣成匀浆，称匀浆l液体样品直接吸取液体样品直接吸取 置于小烧杯中，加蒸馏水置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭，活性炭5g，加加热煮沸热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，用用
13、3040mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，定容，备用。容量瓶中，定容，备用。（2 2）样品处理）样品处理 （3 3）测定）测定 吸取样液吸取样液14mL于刻度试管中，按照标于刻度试管中，按照标准曲线测定准曲线测定结果计算结果计算式中：式中：C-待测溶液的氨基酸含量（待测溶液的氨基酸含量（g）m-样品的质量（样品的质量（g）v1-样品溶液总体积（样品溶液总体积（mL）v2-测定用样品溶液的体积（测定用样品溶液的体积（mL）1.茚三酮受光、空气、温度、湿度等影响而被氧茚三酮受光、空气、温度、湿度等影响而被氧化成淡红色或深红色，使用前必须纯化。化成淡
14、红色或深红色，使用前必须纯化。2.茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在1h保持稳保持稳定，故应抓紧时间比色。定，故应抓紧时间比色。3.该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水。说明与注意事项说明与注意事项方法：方法：普通蒸馏水中加硫酸调至普通蒸馏水中加硫酸调至pH2pH2，使水中各种，使水中各种形态的氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓形态的氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓冲球的蒸馏器进行蒸馏，收集馏出液即可。冲球的蒸馏器进行蒸馏，收集馏出液即可。无氨蒸馏水制备无氨蒸馏水制备利用各种氨基酸的不同性质，使用阳离子利用各种氨基酸的
15、不同性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。洗脱下来的交换树脂在色谱柱上进行分离。洗脱下来的氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸的含量成正比。色深浅与氨基酸的含量成正比。（三）氨基酸自动分析仪法（三）氨基酸自动分析仪法原理原理l水解：水解：准确称取固体样品准确称取固体样品50200mg，小，小心加入水解管中，加入心加入水解管中，加入6mol/L HCl 10mL,酒精喷灯封管后，置烘箱中于酒精喷灯封管后，置烘箱中于110水解水解22-24小时。小时。（1 1）样品处理）样品处理操作步骤操作步骤封管的三种方式封管的三种方式：l液态氮冷冻后
16、封管（注意：冷冻时不能将液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将水解管直接置液氮中，否则容易冻裂）水解管直接置液氮中，否则容易冻裂）l真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，则容易在封管过程中将软化的抽力太大，则容易在封管过程中将软化的玻璃抽碎）玻璃抽碎）l氮吹仪吹氮气氮吹仪吹氮气15分钟后封管分钟后封管。l样品过滤和定容样品过滤和定容：水解后的样品取出冷却至室温，水解后的样品取出冷却至室温，开管后过滤到开管后过滤到25mL容量瓶中，水解管用去离子水洗容量瓶中，水解管用去离子水洗涤涤3次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去
17、离子水洗涤滤纸，洗涤液也收集到容量瓶中。定容。纸，洗涤液也收集到容量瓶中。定容。l脱酸：脱酸：吸取样液吸取样液 1-2mL，置真空脱酸仪上脱酸。温，置真空脱酸仪上脱酸。温度度 60，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。脱酸后的样品，加入脱酸后的样品，加入 1-2mL 蒸馏水溶蒸馏水溶解，置振荡混合器上混合均匀，针管吸解，置振荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过取少量，通过0.45或或0.22m过滤器过滤过滤器过滤后，上机分析。后，上机分析。自动分析仪氨基酸分离图谱自动分析仪氨基酸分离图谱 （2 2）样品分析）样品分析测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面
18、测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积计算出氨基酸的精确含量。根据峰出现积计算出氨基酸的精确含量。根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。的时间可以确定氨基酸的种类。（一）概述（一）概述二、蛋白质的测定二、蛋白质的测定（1 1）蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。（2 2）人体的酸碱平衡、水平衡的维持；）人体的酸碱平衡、水平衡的维持；（3 3）遗传信息的传递；）遗传信息的传递；（4 4
19、）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。（5 5）人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，）人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质；来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质；（6 6）衡量食品的重要营养指标。）衡量食品的重要营养指标。n1.1.蛋白质的生理功用及在食品中的作蛋白质的生理功用及在食品中的作用用2.2.食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量l动物性食品动物性食品：如牛肉中蛋白质含量为如牛肉中蛋白质含量为20.0%，猪肉中为猪肉中为9.5%，兔肉为，兔肉为21%，鸡肉为，鸡肉为20%，牛乳为牛乳为3.5%，黄鱼为
20、黄鱼为17.0%，带鱼为，带鱼为18.0%l植物性食品植物性食品：大豆为大豆为40%，稻米，稻米 为为8.5%，面，面粉为粉为9.9%，菠菜为，菠菜为2.4%，黄瓜为，黄瓜为1.0%，桃为，桃为0.8%，柑橘为，柑橘为0.9%，苹果为，苹果为0.4%和油菜为和油菜为1.5%左右左右 l不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。一般蛋白质一般蛋白质平均平均含氮量为含氮量为16%，即一，即一 份氮素相份氮素相当于当于6.25份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白）称为蛋白质系数质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，不同种类食品的蛋白质
21、系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为，花生为5.46，大，大米为米为5.95，大豆及其制品为，大豆及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为牛乳及其制品为6.38。3.3.蛋白质测定方法蛋白质测定方法 测定蛋白质的方法可分为两大类：测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽、肽键和折射率测定蛋白质含量键和折射率测定蛋白质含量 ；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质
22、含量。量。具体测定方法具体测定方法凯氏定氮法：凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。快速测定法：快速测定法：双缩脲反应、双缩脲反应、Folin-酚法、考马斯酚法、考马斯亮蓝亮蓝G250法法、紫外吸收法、紫外吸收法n考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当其与蛋考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当其与蛋白质结合后变为青色，在一定范围内（白质结合后变为青色，在一定范围内（0-1000g/mL），颜色的深浅与蛋白质含量成正），颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在波长比，在波长595nm下比色，测定吸光度。下比色，测定吸光度。n此反应十分迅速，在此反应十分迅速，在1h内保持稳定，反应非内保持
23、稳定，反应非常灵敏。常灵敏。n原原理理（一）考马斯亮蓝法（一）考马斯亮蓝法 电子天平电子天平v紫外紫外-可见可见分光光度计分光光度计v仪仪器器n试剂（1 1）牛血清白蛋白标准溶液）牛血清白蛋白标准溶液 n（2 2）考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250溶液：溶液：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250+乙醇乙醇+磷酸磷酸（1 1）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制 管号管号 123456100g/mL牛血牛血清白蛋白标准溶清白蛋白标准溶液的量（液的量（mL）00.20.40.60.81蒸馏水的量蒸馏水的量（mL）10.80.60.40.20.0蛋白质浓度蛋白质浓度（g/mL）02040608010
24、0n测定步骤测定步骤 分别向各试管中，加入分别向各试管中，加入5mL考马斯亮蓝，盖塞，考马斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置充分混合，放置2min，于于595 nm下比色，测定下比色，测定吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线标，绘制标准曲线。（2 2）样品处理）样品处理l含水量少的固体样品粉碎，称取含水量少的固体样品粉碎，称取0.1000-0.2000g于离心管中，加蒸馏水于离心管中，加蒸馏水10mL；l 含水量多的固体样品加等量的水捣成含水量多的固体样品加等量的水捣成匀浆，称取匀浆匀浆，称取匀浆2-5g于离心管中，加蒸于离心管中，加蒸
25、馏水馏水6mL；放置放置0.5-1h，以充分提取，而后离心以充分提取，而后离心20min，上清液转入上清液转入10mL容量瓶中，定容。容量瓶中，定容。n（3 3）测定）测定n吸取提取液吸取提取液0.1mL，分别放入，分别放入10mL具塞具塞试管中，加蒸馏水试管中，加蒸馏水0.9mL，加入，加入5mL考马考马斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置2min，于于595 nm下比色，测定吸光度，根据吸光度下比色，测定吸光度，根据吸光度从标准曲线上查得待测液中蛋白质含量。从标准曲线上查得待测液中蛋白质含量。n n（4 4）做空白实验）做空白实验结果计算结果计算式中：式中：C-待测溶液
26、的氨基酸含量（待测溶液的氨基酸含量（g）m-样品的质量（样品的质量（g）v1-样品溶液总体积（样品溶液总体积（mL）v2-测定用样品溶液的体积（测定用样品溶液的体积（mL）说明说明该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，测定蛋白质浓度范围为非常灵敏，测定蛋白质浓度范围为01000g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。测定方法。l灵敏度较低，但操作简单快速，故在灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法；此法；l本法亦适用于豆类、油料、谷类等作本法亦适用于豆
27、类、油料、谷类等作物种子及肉类等样品测定。物种子及肉类等样品测定。n方法特点及应用范围方法特点及应用范围（二）双缩脲法（二）双缩脲法 在碱性溶液中双缩脲在碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)能与能与Cu2+生成紫红色的络合物，这一反应称生成紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与Cu2+发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围（蛋白质含量在一定范围（110mg）内）内成正成正比，可用分光光度计在波长比，可用分光光度计在波长540nm来测其吸来测其吸光度，确定含量。光度，
28、确定含量。原理原理l2H2NC NH2lH2NCNCNH2NH3l1320ClOlOlHlOl尿尿素素l双缩脲双缩脲l双缩脲双缩脲lCuSO4+NaOHl紫红色物紫红色物质质电子天平电子天平v紫外紫外-可见可见分光光度计分光光度计v仪仪器器 （1 1）双缩脲试剂）双缩脲试剂 :硫酸铜硫酸铜+酒石酸钾钠酒石酸钾钠+NaOHv试试剂剂n（2 2）0.05mol/L的的NaOH溶液溶液（3）5mg/mL标准酪蛋白溶液标准酪蛋白溶液（1 1）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制 试剂试剂 管号管号123456标准酪蛋白溶液标准酪蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（蒸馏水（mL）1.00.
29、80.60.40.20双缩脲试剂（双缩脲试剂（mL）444444蛋白质含量（蛋白质含量（mg）01.02.03.04.05.0v测定步骤测定步骤 振荡振荡15min，室温静置室温静置30min，于波长于波长540nm下比色，以蛋白质含量下比色，以蛋白质含量(mg)为为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。曲线。n称取烘干磨碎样品约称取烘干磨碎样品约0.2000g，放入干燥的放入干燥的三角瓶中。然后加入三角瓶中。然后加入5mL 0.05mol/L的的NaOH溶液湿润，之后再加入溶液湿润，之后再加入20mL的双缩的双缩脲试剂，振荡脲试剂，振荡15min，室温静置反应
30、室温静置反应30min，过滤。过滤。（2 2）样品处理）样品处理n取滤液在取滤液在540nm波长下比色，在标准曲波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量线上查出相应的蛋白质含量(mg)。（3 3）样液测定）样液测定结果计算结果计算式中式中：C-从标准曲线上查出得相应的蛋白质含量从标准曲线上查出得相应的蛋白质含量(mg)m-样品的质量（样品的质量（g）1.1.三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。2.2.所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。量。3.3.此法简单、快速、有较好的精确度，分析对此法简单、快速、有较好
31、的精确度，分析对象较广泛，但此法准确度稍低，有色物质、还象较广泛，但此法准确度稍低，有色物质、还原糖、淀粉、脂类等对本法测定谷物样品蛋白原糖、淀粉、脂类等对本法测定谷物样品蛋白质含量干扰较大。质含量干扰较大。说明与注意事项说明与注意事项l凯氏定氮法凯氏定氮法是是测定总有机氮量较为准确的方测定总有机氮量较为准确的方法之一，故国内外应用较为普遍，是法之一，故国内外应用较为普遍，是一一经典经典分析分析方法，至今仍方法，至今仍被作为标准检验方法。被作为标准检验方法。（三）（三）l食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，所以检验
32、食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定。品的蛋白质含量测定。因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。为什么凯氏定氮法测得的蛋白质含为什么凯氏定氮法测得的蛋白质含量为粗蛋白含量？量为粗蛋白含量？1.1.常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法l将样品与浓硫酸
33、和催化剂一同加热消化，使将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。l加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通过加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵。酸铵。l再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。消耗量可计算出蛋白质的含量。v原原理理 样
34、品消化样品消化2NH2(CH)2COOH 13H2SO4 (NH4)2SO4 6CO2 12SO2 16H2Ol浓硫酸具有脱水性，浓硫酸具有脱水性，有机物脱水后被炭化有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮为碳、氢、氮l浓硫酸又具有氧化性浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中留在酸性溶液中。硫酸铜：硫酸铜：
35、起催化剂的作用。还有氧化汞、起催化剂的作用。还有氧化汞、汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。硫酸钾：硫酸钾：目的是为了提高溶液的沸点，目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解加快有机物的分解（纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340340，加，加入硫酸钾之后可以提高至入硫酸钾之后可以提高至400400以上。）以上。）。也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。点，但效果不如硫酸钾。在消化时常加入硫酸钾、硫酸铜等催化剂在消化时常加入硫酸钾、
36、硫酸铜等催化剂 蒸馏蒸馏a 适用范围适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定仪器仪器500mL凯氏烧瓶凯氏烧瓶；定氮蒸馏装置定氮蒸馏装置（1 1）浓硫酸浓硫酸（2 2）硫酸铜）硫酸铜（3 3）硫酸钾）硫酸钾 v 试试剂剂v（4 4）40%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 v（5 5）4%硼酸吸收液硼酸吸收液（6 6）0.1mol/L HCl标准溶液标准溶液v（7 7）甲基红和溴甲酚氯混合指示）甲基红和溴甲酚氯混合指示剂剂1份份0.2%的甲基红乙醇溶液和的甲基红乙醇溶液和5份份0.2%溴甲酚氯乙醇溴甲酚氯乙醇溶液混合。溶液混合。称取固体样品称取固体样品0.200
37、02.0000g（液体样品液体样品1020mL，半固体样品，半固体样品25g），），小心放于小心放于500mL凯氏烧瓶中，加入研细的硫酸铜凯氏烧瓶中，加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾硫酸钾10g，浓硫酸浓硫酸20mL，轻轻摇匀，在凯，轻轻摇匀，在凯氏瓶口盖一小漏斗，斜放于电炉上小火加热氏瓶口盖一小漏斗，斜放于电炉上小火加热(在通风橱内加热消化在通风橱内加热消化),待内容物全部炭化，泡待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变为透明的蓝绿色后，再继续加沸，至液体变为透明的蓝绿色后，再继续加热微沸热微沸30min，冷却。冷却。加入加
38、入200mL蒸馏水，加蒸馏水，加入玻璃珠数粒。入玻璃珠数粒。v测 定 步测 定 步骤骤（1 1）样品消化）样品消化 将凯氏烧瓶连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端将凯氏烧瓶连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面以下，接收瓶内预先装有插入接收瓶液面以下，接收瓶内预先装有50mL 4%硼酸溶液和硼酸溶液和23滴混合指示剂，放滴混合指示剂，放松夹子，通过漏斗加入松夹子，通过漏斗加入7080mL 40%氢氧化氢氧化钠溶液并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为钠溶液并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为深蓝深蓝色，或产生黑色沉淀色，或产生黑色沉淀，再从漏斗加入，再从漏斗加入100 mL蒸馏水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸蒸馏
39、水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏出液约为出（馏出液约为250 mL），将冷凝管下端提），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴溜出液，用表面皿接几滴溜出液，用奈氏试剂检查，用奈氏试剂检查，如无红棕色物质生成，表示蒸馏完毕。如无红棕色物质生成，表示蒸馏完毕。（2 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收将上述吸收液用将上述吸收液用0.1mol/L HCl标准溶液滴定，标准溶液滴定，至溶液由至溶液由蓝绿色变为紫红色即为滴定终点蓝绿色变为紫红色即为滴定终点，记录消耗记录消耗HCl标准溶液的体积。标准溶液的体积。（3 3）滴定）滴定（4 4
40、）做空白实验）做空白实验式中式中:c盐酸标准液的浓度盐酸标准液的浓度(mol/L)V0空白滴定消耗标准液量空白滴定消耗标准液量(mL)V1试剂滴定消耗标准液量试剂滴定消耗标准液量(mL)m样品质量样品质量(g)0.014氮的毫摩尔质量氮的毫摩尔质量(g/mmol)6.25蛋白质蛋白质换算换算系数。系数。v结果计算结果计算1.1.所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。2.2.消化时不要用强火，注意不断转动凯氏烧瓶，消化时不要用强火，注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。下并促进其消化完全
41、。3.3.样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。意控制热源强度。说明及注意事项说明及注意事项4.4.当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入烧瓶冷却，加入30过氧化氢过氧化氢23mL后再继后再继续加热消化。续加热消化。5 5.若取样量较大，如干试样超过若取样量
42、较大，如干试样超过5g，可按每可按每克试样克试样5mL的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。6.6.一般消化至呈透明后，继续消化一般消化至呈透明后，继续消化30min即即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。7.7.蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。8.8.蒸馏前若加碱量不足，
43、消化液呈蓝色不生成蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。9.9.硼酸吸收液的温度不应超过硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。的吸收作用减弱而造成损失。10.10.蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提高液面蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提高液面清洗管口，再蒸溜清洗管口，再蒸溜lmin后后关掉热源，否则可能关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸现象。造成吸收液倒吸现象。2.2.微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 v凯氏烧瓶凯氏烧瓶(100ml)(100ml)微量凯氏定氮装置微量凯氏定氮装置v原理原理:同
44、常量定氮法同常量定氮法v仪仪器器v（1）0.01mol/L盐酸标准溶液盐酸标准溶液 v（2）2%硼酸吸收液硼酸吸收液v 其他试剂同常量凯氏定氮法其他试剂同常量凯氏定氮法 v试试剂剂（1 1）样品消化）样品消化v测 定 步测 定 步骤骤v称取固体样品称取固体样品0.20000.5000g（液体样品液体样品1020mL，半固体样品，半固体样品25g），），小心放于小心放于100mL凯氏烧瓶中，加入研细的硫酸铜凯氏烧瓶中，加入研细的硫酸铜0.3g，硫硫酸钾酸钾0.9g，浓硫酸浓硫酸15mL，轻轻摇匀，在凯氏瓶，轻轻摇匀，在凯氏瓶口盖一小漏斗，斜放于电炉上小火加热，待内口盖一小漏斗，斜放于电炉上小火加
45、热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变为透明的蓝绿色保持瓶内液体微沸，至液体变为透明的蓝绿色后，再继续加热微沸后，再继续加热微沸30min，冷却，完全转入冷却，完全转入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。清洗仪器清洗仪器：在水蒸汽发生器中加约：在水蒸汽发生器中加约2/3体积的体积的蒸馏水，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，蒸馏水，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加数粒玻璃珠，安装好微以保持水呈酸性，加数粒玻璃珠，安装好微量定氮装置，打开漏斗下夹子，加热至水沸量定氮装置
46、，打开漏斗下夹子，加热至水沸腾，使蒸汽通入仪器的每个部分，达到清洗腾，使蒸汽通入仪器的每个部分，达到清洗的目的，在冷凝管下端放置一三角瓶接冷凝的目的，在冷凝管下端放置一三角瓶接冷凝水，然后，夹紧漏斗下的夹子，再冲洗水，然后，夹紧漏斗下的夹子，再冲洗5min，冲洗完毕，夹紧蒸汽发生器和收集器间的连冲洗完毕，夹紧蒸汽发生器和收集器间的连接橡皮管，蒸馏瓶中的废液由于减压倒吸到接橡皮管，蒸馏瓶中的废液由于减压倒吸到收集器中，打开收集器下端的活塞排除废液，收集器中，打开收集器下端的活塞排除废液，如此清洗如此清洗23次。次。（2 2）蒸馏、吸）蒸馏、吸收收 蒸馏、吸收：蒸馏、吸收：取消化稀释液取消化稀释液
47、10mL10mL由进样漏由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入并流入反应室。再从进样口加入l0mL 40%l0mL 40%氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗进样漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸洗进样漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸汽蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有汽蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有20mL 2%20mL 2%硼酸吸收液和硼酸吸收液和2323滴混合指示剂的液面下。滴混合指示剂的液面下。蒸馏至吸收液中由紫红色变为蓝绿色时，蒸馏至吸收液中由紫红色变为蓝绿色时，继续蒸馏继续蒸馏10min1
48、0min后，将冷凝管下端提离液面后，将冷凝管下端提离液面再蒸馏再蒸馏lminlmin，用蒸馏水冲洗冷凝管下端后，用蒸馏水冲洗冷凝管下端后停止蒸馏。停止蒸馏。（4 4）做空白实验）做空白实验取下接收瓶用取下接收瓶用0.01mol/L HCl标准溶液滴定标准溶液滴定至由蓝绿色变为紫红色为终点。至由蓝绿色变为紫红色为终点。（3 3）滴定）滴定全自动凯氏定氮仪全自动凯氏定氮仪v结果计算结果计算 式中：式中：V0滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积（滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积（mL）V1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积（滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积（mL）10蒸馏时吸取样品稀释液体积（蒸馏时吸取样
49、品稀释液体积（mL）100 样品稀释液总体积（样品稀释液总体积（mL）C盐酸标准液的浓度（盐酸标准液的浓度（mol/L）0.014氮的毫摩尔质量（氮的毫摩尔质量（g/mmol）6.25蛋白质换算系数蛋白质换算系数 m样品质量（样品质量（g）1.1.甲醛滴定法测定氨基酸态氮的原理是什么？甲醛滴定法测定氨基酸态氮的原理是什么？在操作中在操作中应注意什么问题？应注意什么问题？2.2.在加入甲醛之前为什么要用氢氧化钠标准溶液滴定至在加入甲醛之前为什么要用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色？溶液呈浅红色？3.3.简述茚三酮比色法测定氨基酸总量的原理和操作要点。简述茚三酮比色法测定氨基酸总量的原理和操作要
50、点。4.4.考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250法测定蛋白质含量的原理是什么法测定蛋白质含量的原理是什么?5.5.双缩脲法测定蛋白质含量的原理是什么双缩脲法测定蛋白质含量的原理是什么?6.6.测定蛋白质含量的方法有哪些？测定蛋白质含量的方法有哪些？7.7.简述凯氏定氮法的原理。为什么说用凯氏定氮法测得简述凯氏定氮法的原理。为什么说用凯氏定氮法测得的蛋白质含量为粗蛋白含量的蛋白质含量为粗蛋白含量?蛋白质测定结果为什么要蛋白质测定结果为什么要乘以蛋白质换算系数？乘以蛋白质换算系数？8.8.在样品消化过程中加入的硫酸铜、硫酸钾试剂有哪些在样品消化过程中加入的硫酸铜、硫酸钾试剂有哪些作用？样品消化过程
