1、第二十三章第二十三章 DNADNA操作的基本技术操作的基本技术 The Basic Technologies for DNA Manipulations 2 第一节第一节 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交 Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization 什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以以DNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础 指指具有一定同源序列具有一定同源序列的两条核酸单链（的两条核酸单链（DNA或或 RNA）
2、，在一定条件下按），在一定条件下按碱基互补配对原则碱基互补配对原则经经 过复性处理后，形成过复性处理后，形成异源双链异源双链的过程的过程 一、一、Southern 印迹可用于分析基因印迹可用于分析基因 拷贝数的变化拷贝数的变化 由由E. M. Southern在在1975年提出年提出 可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括基本操作过程包括 待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记； 待测待测DNA样品的电泳分离；样品的电泳分离； 电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、固定到合适的 固相支持物；固相支持物；
3、特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自 显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。 Southern印迹分析基本流程印迹分析基本流程 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸 电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影 酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹 重物 缓冲液 二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR可用于可用于 分析基因转录水平的变化分析基因转录水平的变化 Northern blot是将是将RNA从凝胶中转印到硝从凝胶中转印到硝 酸纤维素膜上酸纤维素膜上，定性分析定性分析mRNA的常用方的常用方 法；法； RT-
4、PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成 cDNA、再以再以cDNA为模板进行特异性扩增为模板进行特异性扩增， 进行进行RNA定性或定量分析的一种方法；定性或定量分析的一种方法； 二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化 。 三、原位分子杂交技术可用于基因及其三、原位分子杂交技术可用于基因及其 表达产物的定位分析表达产物的定位分析 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即）即 利用分子杂交技术来进行基因及其表达产利用分子杂交技术来进行基因及其表达产 物定位分析的一种技术；物定位分析的一种技术； 可用于基因及其表达产物的
5、定位分析。可用于基因及其表达产物的定位分析。 8 FISH 箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置 第二节第二节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction 什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由由K. Mullis于于1983年建立年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时
6、、定量分析可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列序列 的相互作用。的相互作用。 PCR技术的工作原理技术的工作原理 5 3 3 5 5 3 3 5 + + 5 5 变性、退火变性、退火 引物引物 5 3 3 5 + 5 5 dNTPs Taq DNA聚合酶聚合酶 不同长度新链不同长度新链DNA 循环循环1 + 引物引物 变性、退火变性、退火 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增 5 3 3 5 + 5 3 3 5 + + 5 3 3 5 + 5 3 3 5 + + dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶 均一长
7、度新链均一长度新链DNADNA 循环循环2 一、一、PCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物 反转录反转录PCR（reverse transcription PCR， RT-PCR）是将是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR 反应联合应用的一种技术反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基是目前从组织或细胞中获得目的基 因以及对已知序列的因以及对已知序列的RNA进行定性及半定进行定性及半定 量分析的最有效方法量分析的最有效方法。 mRNA 5 AAAAAA(n) 3 mRNA 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 mRNA 5 cDNA 3
8、AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 oligo(dT)12-18 反转录酶反转录酶 RNase H DNA 聚合酶聚合酶 S1 核酸酶核酸酶 3 cDNA TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 反转录合成反转录合成cDNA 二、二、PCR技术可以进行实时、技术可以进行实时、 定量分析定量分析 Q R 3 3 5 5 上游上游 引物引物 下游下游 引物引物 荧光标记引物荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 三、三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质 结合的结合的DNA序列序列 第三节
9、第三节 DNA序列测定序列测定 DNA Sequencing * DNA序列分析方法的演变和发展序列分析方法的演变和发展 20世纪世纪70年代年代 双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：F. Sanger 化学裂解法：化学裂解法：A. Maxam和和W. Gilbert 20世纪世纪80年代年代 PCR及自动测序技术及自动测序技术 一、一、DNADNA序列分析有双脱氧链终止法和序列分析有双脱氧链终止法和 化学裂解法化学裂解法 （一）（一）Sanger双脱氧链终止法利用双脱氧链终止法利用2，3 - 双脱氧核苷酸掺入中双脱氧核苷酸掺入中 （二）（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化化学裂解法利
10、用化 学试剂裂解修饰碱基学试剂裂解修饰碱基止聚合反应止聚合反应 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 G A T C 测序反应测序反应 电泳电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极正极 负极负极 ddG ddA ddT ddC DNA序列自动分析序列自动分析 ddG 红红 ddT ddA 绿绿 ddC 蓝蓝 橙橙 毛细管电泳毛细管电泳 荧光标记荧光标记 DNA合成合成 测序结果展示测序结果展示 二、二、DNA序列分析可以揭示基因和序列分析可以揭示基因和 基因组一级结构变化基因组一级结构变化 通过
11、通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组序列分析可以鉴定基因和基因组 的变异的变异 通过通过DNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因 通过通过DNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认 第四节第四节 DNA芯片技术芯片技术 DNA Chip Technologies 什么是什么是DNA芯片技术芯片技术 DNA芯片（芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，探针， 与待测荧光标记样品进行杂交；与待测荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样 品
12、的遗传信息品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。 基因芯片工作流程基因芯片工作流程 一、利用一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量芯片技术可同时进行高通量 基因转录活性的分析基因转录活性的分析 cDNA芯片每个探针是芯片每个探针是cDNA片段或基因的片段或基因的 一段一段PCR产物产物，可以同任何具有同源序列可以同任何具有同源序列 的样品形成杂交体的样品形成杂交体，同时定量监测大量基同时定量监测大量基 因的表达因的表达。 寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片 段为探针段为探针，每个
13、基因有每个基因有1020个相对应的探个相对应的探 针针，对低丰度基因表达水平变化的检测具对低丰度基因表达水平变化的检测具 有高度灵敏性有高度灵敏性。 二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合 检测蛋白质检测蛋白质-DNA相互作用相互作用 染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀-芯片（芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip） 特异性地富集目的蛋白结合的特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段片段，解交解交 联后对目的片段进行纯化联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记扩增和荧光标记， 再用于芯片分析；再用于芯片分析；
14、寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得获得 蛋白质与蛋白质与DNA相互作用的信息相互作用的信息。 ChIP-on-chip工作原理工作原理 第五节第五节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统酵母及哺乳动物细胞杂交系统 Yeast and Mammalian Hybrid Systems 一、酵母双杂交探测蛋白一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用 酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 由由S. Fields 和和O. Song 于于1989年提出并初步年提出并初步 建立建立 酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技
15、术的基本原理 二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞 酵母单杂交技术酵母单杂交技术（yeast one-hybrid）由由J. Li于于1993年从酵母双杂交技术发展而来年从酵母双杂交技术发展而来 是体外分析是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一与细胞内蛋白质相互作用的一 种方法；种方法； 通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析， 鉴别鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。 酵母单杂交技术的基本原理酵母单杂交技术的基本原理 三、蛋白质三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母相互作
16、用也可采用酵母 三杂交系统进行分析三杂交系统进行分析 酵 母 三 杂 交 系 统酵 母 三 杂 交 系 统 （ yeast three-hybrid system）于于1996年由年由D.J.SenGupta等首先报等首先报 道道 （一一）用于蛋白质用于蛋白质-RNA相互作用分析的酵母相互作用分析的酵母 三杂交系统需要杂合三杂交系统需要杂合RNA 酵母三杂交基本原理酵母三杂交基本原理 （二）酵母三杂交系统应用范围广泛（二）酵母三杂交系统应用范围广泛 可进行与特定蛋白结合的未知可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选；的筛选； 确定确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；蛋白质相互作用的结构域； 鉴定鉴定、分离能够识别具有重要生理功能分离能够识别具有重要生理功能 RNA的的RNA结合蛋白结合蛋白。
