1、蛋白质定量测定蛋白质定量测定 ( (一一) )基本原理基本原理 分光光度法是利用物质对某种波长的光具有分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选选 择性吸收择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其的特性建立起来的鉴别物质或测定其 含量的一项技术。含量的一项技术。 LambertLambert- -BeerBeer定律：定律： A=KLC 直接法：直接法： 紫外分光光度法紫外分光光度法(50(50100100 g g) ) 间接法：间接法： 双缩脲法（双缩脲法（1 110mg)10mg) BCABCA（二喹啉甲酸）法（二喹啉甲酸）法（2020200200 g g） LowryLowry改良法改良法
2、 (1(11515 g)g) 考马斯考马斯( (ComessieComessie) )亮兰结合法（亮兰结合法（1 11010 g g） 凯氏定氮法凯氏定氮法( (0.20.21.0mg1.0mg) ) 4 5 双缩脲双缩脲(NH2CONHCONH2)(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红 色化合物，称为双缩脲反应。色化合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽键蛋白质分子中含有许多肽键( (- -CONHCONH- -) )在碱性溶液中也能与在碱性溶液中也能与 Cu2+Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅反应产生紫红
3、色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅 与蛋白质浓度成正比。与蛋白质浓度成正比。 操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小；操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小； 灵敏度较差，特异性不高。灵敏度较差，特异性不高。- -CONH2CONH2、 - -CH2NH2CH2NH2、- -CSCS- -NH2NH2等等 基团也有此反应。基团也有此反应。 7 1 1标准曲线的作法标准曲线的作法 (1) (1) 标准液浓度的选择：标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般 应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可应能包括待测样品的可能变异最低与最高
4、值，一般可选择选择5 5种种 浓度浓度。浓度差距最好是。浓度差距最好是成倍增加或等级增加成倍增加或等级增加，并应与被测液，并应与被测液 同样条件下显色测定。同样条件下显色测定。 (2) (2) 标准液的测定：标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读在比色时，读取光密度至少读2 2- -3 3次，求其平次，求其平 均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 (3) (3) 标准曲线图的绘制标准曲线图的绘制：一般常用一般常用光密度一浓度标准曲线光密度一浓度标准曲线。 8 2 2标准曲线的作用标准曲线的作用 (1)(1)标准曲线又叫做标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线校正
5、曲线或工作曲线。从浓度一光密度。从浓度一光密度 直线的直线特性，判断所采用方法的直线的直线特性，判断所采用方法的呈色反应是否符合呈色反应是否符合 lambertlambertBeerBeer定律定律。 (2)(2)作作多次平行测定多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程绘制标准曲线，可判断在整个测定过程 中操作、仪器等误差的大小，确定该中操作、仪器等误差的大小，确定该测定方法的可靠性测定方法的可靠性。 (3)(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度灵敏度。 (4)(4)大批样品分析时，大批样品分析时，省略多次计算省略多次计算，从光密度值直接
6、查阅，从光密度值直接查阅 标准曲线而求得被测物质的浓度。标准曲线而求得被测物质的浓度。 9 根据三个原则：根据三个原则： 1.1.被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为0.10.1- - 0.70.7， 以以0.20.2- - 0.60.6最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产 生很大的相对误差，反之，过高的光密度则超过直线范围生很大的相对误差，反之，过高的光密度则超过直线范围 而引入误差。而引入误差。 2.2.应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如遇不易应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如遇不易 去除的干扰
7、色泽，应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。去除的干扰色泽，应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。 3.3.应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。 10 试剂试剂 标准管标准管 测定管测定管 空白管空白管 1 2 3 4 5 6 7 蛋白质标准液蛋白质标准液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 待测血清样本待测血清样本(ml) 1.0 0.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩脲试剂双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 11 ( (一一) )在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度在座
8、标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度 为横座标绘制标准曲线。为横座标绘制标准曲线。 ( (二二) )从从标准曲线中查出标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度待测血清样本的蛋白质浓度 (g/L)(g/L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。，并求出人血清样本的蛋白质浓度。 ( (三三) )从从标准管中选择标准管中选择一管与测定管一管与测定管光密度相接近光密度相接近者，者， 求出人血清样本的蛋白质浓度求出人血清样本的蛋白质浓度(g/L)(g/L)。 12 管号管号 A A 值值 标准管标准管 测定管测定管 空白管空白管 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 A A值值 0.000 日
9、期，室温日期，室温 实验项目实验项目 13 1 1、实验原理（清晰）、实验原理（清晰） 2 2、实验步骤（简略但清晰）、实验步骤（简略但清晰） 3 3、数据记录及实验结果计算数据记录及实验结果计算（数据带入的过程，（数据带入的过程， 若为定性实验则为观察到的现象）若为定性实验则为观察到的现象） 4 4、实验结论、实验结论 5 5、实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改、实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改 良的地方等）良的地方等） 将原始记录置于最后一页，装订一同上交将原始记录置于最后一页，装订一同上交 日期、室温日期、室温 14 标准曲线标准曲线 根据Lambert-Beer定律，定律， A A与与C C成正比成正比 配制一系列标准液配制一系列标准液 C1、C2、C3， 在在 max下，测相应的下，测相应的A1、 A2、A3。 仪器型号仪器型号 波长波长 日期日期 室温室温 测定物及测定方法名称测定物及测定方法名称 mg/mlmg/ml
