1、第十三章 免疫细胞的凋亡n有核细胞一方面存在细胞分裂、增殖的功能，另一方面又有主动发生死亡的机制，即细胞凋亡。这两种功能均受遗传严格控制并维持细胞死亡和增殖的平衡，是多细胞动物借以存活的需要，因而这一对矛盾始终贯穿着动物整个生命过程。n细胞凋亡在免疫系统的发育、分化和成熟以及保持其功能稳定性方面均发挥着重要作用。n细胞凋亡是免疫细胞进化过程中的一种高度保守的基本生理功能。然而，宿主在与病毒相互作用中所发生的凋亡并不都一定有利于宿主。第一节 凋亡的生物学特征一、凋亡的概念n凋亡(apoptosis)是机体的正常细胞在受到生理性和病理性刺激后启动的自发的死亡过程，是一种主动的、信号依赖的过程。其典
2、型的特征是一种内源性核酸内切酶的激活和由此导致的细胞染色体DNA的降解。这种细胞死亡方式的另一个特点是，降解的胞浆及胞核成份被包裹于膜性成分中而形成凋亡小体。胞膜成分和结构的改变可以被吞噬细胞表面的粘附分子及磷脂酰丝氨酸受体(phosphatidylserine receptor)快速识别，凋亡细胞被吞噬并降解，因此不引起局部的炎症反应。n凋亡的形态特征是，细胞首先皱缩，随即与邻近细胞脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内织网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高呈半月形，并凝集在核膜周边，核仁裂解，进而胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外溢的细胞小体凋亡小体。二、凋亡与坏死、程序化
3、死亡n1坏死(necrosis)是一种病理状态下的细胞死亡。它是由于某些外界因素，比如局部缺血、高热以及物理、化学损伤和生物的侵袭等，造成细胞急速死亡。细胞坏死首先是膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内织网扩张，核染色质不规则地移位，进而线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，胞浆外溢。这种死亡过程常常引起炎症反应。n2程序化死亡(programmed cell death,PCD)与细胞凋亡在概念上是有区别的。细胞凋亡是形态学的概念，而PCD是功能性的概念，细胞凋亡是PCD的一种形式。第二节 细胞凋亡的诱导剂和抑制剂n多种因素可参与诱导和抑制细胞凋亡。诱导凋亡的因素众多，可分为：（1）物
4、理性，如放射线、紫外线、高温；（2）化学性，如抗癌药物、氧自由基、一氧化氮；（3）微生物，如HIV、EBV；（4）缺乏细胞生长必需因子，如干细胞生长因子、雌激素、雄激素；（5）免疫性，指抗原和免疫应答过程中所产生的细胞因子和细胞膜分子。慢性缺血、营养耗尽等也可导致细胞凋亡。（一）Ca2+、Mg2+n内源性DNA内切酶为Ca2+/Mg2+依赖性，故胞内Ca2+/Mg2+浓度升高可诱导细胞发生凋亡。直接用含Ca2+/Mg2+的溶液与胸腺细胞孵育，90分钟即可检出DNA水解片段。nCa2+不仅是细胞凋亡的诱导剂，在其他因素诱导凋亡的信号传导过程中，Ca2+也是重要的信号分子。Zn2+拮抗Ca2+/M
5、g2+的作用。（二）糖皮质激素n糖皮质激素是常见的凋亡诱导剂。未成熟的胸腺细胞对激素诱导的凋亡敏感，而成熟的T细胞则不敏感。蛋白合成抑制剂（放线菌素D、放线菌酮）可拮抗糖皮质激素的致凋亡作用，表明糖皮质激素诱导的凋亡与新蛋白质的合成有关。（三）细胞因子（CK）n某些CK有促进凋亡的作用（如TNF等），n某些CK则抑制凋亡（如IL-3、GM-CSF等）。n另外一些CK，如IL-2、IFN-、I-10等，对凋亡的发生有双重效应。IL-2一般可维持细胞生存和抑制凋亡。T细胞培养时若去除IL-2，则会发生凋亡。但也有人发现，若先用IL-2处理T细胞再用抗原刺激，可引起凋亡；应用IL-2抗体则可抑制T细
6、胞凋亡。n由此可见，CK受体的表达水平对于细胞凋亡的调节具有重要意义。（四）细胞表面受体和配体的相互作用nT细胞的CD28与其它细胞上的B7的相互作用，以及B细胞的CD40与T细胞上的CD40L相互作用，可诱导细胞内抑制凋亡的基因的表达，从而不利于凋亡的发生。（五）抗体n针对多种细胞表面成分的抗体，如抗IgM、抗Fas、抗CD3TCR、抗CD4、抗CD8、抗CD23抗体等，均可诱导细胞凋亡。n不同的抗体可使表达相应膜抗原的不同细胞发生凋亡，但相同的抗体-膜抗原系统在不同的细胞也可能产生不同的效应。如抗CD3单抗可诱导未成熟T细胞凋亡，但可促进成熟T细胞增殖。（六）细胞内信号分子调节剂n某些胞内
7、信号分子调节剂对不同靶细胞可分别具有诱导或抑制凋亡的作用。如蛋白激酶C（PKC）激活剂PMA可抑制鼠T、B细胞凋亡，但可诱导鼠胸腺细胞的凋亡。n上述结果提示，PKC在成熟或未成熟淋巴细胞的凋亡信号传递过程中发挥不同效应。（七）超抗原、丝裂原n超抗原金色葡萄球菌肠毒素可诱导胸腺内CD4+CD8+细胞凋亡n丝裂原PWM可诱导成熟及未成熟T细胞凋亡。第三节 细胞凋亡的生化改变一、胞内Ca2+浓度增高n在所有类型的细胞凋亡过程中，都观察到胞内Ca2+浓度增高，这可能是由于Ca2+内流所致。n已发现，应用钙离子载体可诱导细胞发生凋亡，提示Ca2+本身可能就是凋亡的启动因素之一。n应用类固醇激素诱导培养细
8、胞发生凋亡，其条件是培养环境中必须有Ca2+存在，若去除培养基中的Ca2+，则凋亡不能发生。二、内源性核酸内切酶激活 n细胞发生调亡时，DNA被从核小体连接处水解，因此形成180200bp或其倍数的片段，这主要是由于内源性核酸内切酶被激活的结果。该酶为Ca2+Mg2+依赖性，而Zn2+则是该内切酶的有效抑制剂。n生理状况下，核内Zn2+浓度较高；发生凋亡时，可能由于胞浆Ca2+浓度增高，置换了核内的Zn2+，从而激活内切酶并水解DNA。三、生物大分子的合成 n凋亡过程的发生一般需要合成新的RNA和蛋白质，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，即为如此。蛋白质或RNA合成
9、抑制剂如吐根碱、放线菌素等可抑制这种类型凋亡的发生。n已发现，凋亡细胞中许多酶的含量增加，如转氨酶、核糖核酸酶、组织蛋白酶、-谷酰转移酶、转肽酶等。n另外，某些细胞凋亡的诱因可激活与凋亡发生有关的基因（详后），后者编码相应的蛋白产物，也使蛋白质合成增加。第四节 凋亡的启动n细胞存活除了受生长因子和细胞死亡受体的外在调节外，胞内事件也能启动凋亡。nDNA的损伤能够诱导凋亡，其中的大部分信号传导途径都由p53介导。对程序性细胞死亡的耐受有助于肿瘤的发生，由此可以解释为什么如此众多的人类癌症中都存在p53的突变。n事实上，任何持续存在的细胞新陈代谢或细胞周期的混乱都能诱导凋亡。n这些现象提示，凋亡的
10、调控可能不仅仅是通过单一信号途径来实现的，而是由各种信号通路的相互协调来调节程序性细胞死亡的易感性。n虽然这些细胞新陈代谢或周期干扰调控程序性细胞死亡的特定结合点尚未确定，但已发现一些涉及细胞存活调控的胞内干扰控现象。n在众多不同的细胞系统中，胞内钙的升高、胞内pH值的下降以及细胞氧化还原电位的改变都可以增加细胞对PCD的敏感性。n与其他凋亡通路不同，通过细胞表面受体启动凋亡的信号通路已逐渐被确定。例如，TNF相关受体启动的信号通路都涉及蛋白酶的激活。在细胞死亡受体介导的凋亡信号通路中，最典型的蛋白酶即是caspase家族的成员。第五节 死亡受体介导的细胞凋亡一、肿瘤坏死因子受体超家族n死亡受
11、体是一组膜表面受体，与相应的配体结合后，可以引起受体表达细胞的凋亡。n死亡受体都属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，该家族也被称为神经生长因子受体(NGFR)超家族。nTNFR超家族成员都是I型膜表面受体，除死亡受体外，还包括一些能引起细胞增殖、活化等反应的分子。nTNFR超家族成员的膜配体都是II型膜蛋白，这些配体构成了TNF超家族。（一）TNFR超家族的结构特征nTNFR超家族和TNF超家族是以结构为基础的，各成员间不仅在氨基酸序列上具有不同程度的同源性，而且在空间结构上也很相似。nTNFR超家族成员均为I型跨膜糖蛋白，它们在胞膜外区含有2-6个约由40个氨基酸残基组成的富含半胱氨酸的
12、结构域(cysteine-rich domain,CRD)。nTNFR超家族成员的胞浆区变化比较大，最短的只有21aa，最长的如TNFRI，有233aa。各成员间胞浆区没有明显的同源性，但介导细胞凋亡信号的成员，如TNFRI和Fas的胞浆区均含有约一个60 80aa的同源序列，称为死亡结构域(death domain，DD)，该结构域与这些受体的凋亡信号及其它信号的转导有关。（二）TNFR超家族的成员n死亡受体包括TNFRI、Fas、DR3、DR4、DR5、CAR1等，它们的共同特征是胞浆区都有DD，死亡受体通过这个结构域与胞浆中介导细胞凋亡信号的蛋白质结合，通过后者启动细胞内部的凋亡程序，引
13、起细胞凋亡，所以这个结构域被称为死亡结构域。n1Fas/FasLn（1）Fas与FasL的结构与分布 Fas（CD95）也称Apo-1，Fas基因定位于人染色体10q24.1。其编码产物分子量为45kDa的 I 型跨膜蛋白，由胞外区（157aa）、跨膜区（17aa）及胞浆区（145aa）组成。n对Fas胞浆区氨基酸序列的比较发现，它与TNFRI有一段68aa的同源序列，这段序列对Fas和TNFRI所介导的细胞凋亡起着决定性的作用，用基因突变的方法将同源区进行改造后，它们就丧失了致凋亡的能力，所以这一同源区被命名为死亡结构域（death domain，DD）。n以后的研究发现，死亡结构域也存在于
14、其它死亡受体以及一些胞浆内信号转导蛋白，受体的死亡结构域可以与胞浆信号蛋白的死亡结构域发生同源或异源结合，所以这个结构域的作用是作为一个接头将死亡受体与胞浆信号通路联系起来。nFas主要以膜受体形式存在，还可通过在转录水平的不同拼接产生可溶性Fas分子（sFas），后者在细胞凋亡中起调节作用。nFas较广泛地分布于多种类型的细胞，包括外周活化T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝胆管细胞、卵巢细胞、子宫内膜细胞及皮肤组织细胞等。n某些组织细胞经活化后也可诱导Fas表达。nFasL（CD95L）为TNF相关的II型膜分子，基因位于1号染色体，长278aa，分子量4
15、0kDa，其N端在胞浆内，跨膜部有一疏水域，其C端位于胞膜外，胞外区约150个氨基酸与TNF家族成员高度同源。n因FasL能与Fas结合诱发凋亡，故把FasL称死亡因子。nFasL亦可分泌或脱落至细胞外，成为可溶性的功能活性分子。nFasL主要表达于活化的T淋巴细胞。n（2）Fas和FasL的生物学效应 TNFR/NGFR超家族中，只有Fas和TNFR I型可介导细胞凋亡，而且Fas介导细胞凋亡必须具备3个条件：细胞表达足够密度的Fas；Fas与其配体或单抗作用形成三聚体；细胞关闭抗凋亡程序而成为凋亡敏感型细胞。虽然许多组织均可表达Fas，但免疫系统对Fas系统介导的细胞凋亡最为敏感。n（3）
16、Fas和FasL诱导细胞凋亡的机制 nFas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。nFas作为一种普遍表达的受体分子，可以出现在多种细胞表面，包括淋巴细胞。但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞(特别是活化的CTL)和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。n表达FasL的效应杀伤细胞会与自身表达的Fas结合，诱导自身的凋亡过程（AICD）。nFas分子胞内段带有特殊的死亡结构域(DD,death domain)。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相
17、聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。nFADD由两部分组成：DD和DED。DED指死亡效应结构域，因而FADD是死亡信号转导中的一个连接蛋白。该蛋白再以其DED连接另一个带有DED的后续成分，即caspase 8，后者作为酶原而被激活，引发一组caspase的级联反应。n（4）Fas/FasL异常所引起的疾病 n小鼠天然突变性疾病(lymphoproliferation，lpr)的突变发生于小鼠19号常染色体。n对lpr小鼠Fas基因的分析发现，一个长约5.7kb的反转座子ETn插入到Fas基因的第二个内含子。这个ETn在长末端重复序列(LTR)中带有一个多聚腺苷酸信号
18、(AATAAA)，引起Fas基因的异常剪接和提前终止。在lpr小鼠肝脏和胸腺只有非常少的Fas mRNA，而且往往成熟mRNA中只有外显子1和2，不能编码正常Fas。nlpr小鼠明显的特征是出现大量自身反应性CD4+T细胞，能辅助B细胞产生抗体，而不出现AICD。n2TNFRI n（1）TNFRI的结构 n肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)，CD编号为CD120a，是5560kD I型跨膜糖蛋白，成熟膜蛋白长426aa。胞膜外区(182aa)有4个CRD，其中有3个N-糖基化位点。跨膜区有21aa，胞浆区较长，有223aa，有3个蛋白激酶C(PKC)作用位点，1个蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位
19、点。TNFRI在胞浆区有一个约80aa的死亡结构域。n（2）TNFRI的生物学功能 nTNFRI与配体TNF结合后，主要介导凋亡信号，引起细胞凋亡，在抗肿瘤和抗病毒感染中发挥着重要的作用，同时也参与自身免疫性疾病和败血症中对自身组织细胞的损伤。nTNFRI也可以介导活化信号和增殖信号，诱导一氧化氮合成酶和IL-8的活性，活化核转录因子NF-B和AP-1。二、肿瘤坏死因子受体超家族的信号转导蛋白n含有死亡结构域的胞浆蛋白包括TRADD、FADD、RIP，以及新发现的CRADD、MADD等，它们在肽链的羧基端都有一段同源的死亡结构域。这些蛋白质通过死亡结构域与死亡受体的胞浆区相作用，并传递死亡受体
20、活化后引起的种信号。n死亡结构域不具有蛋白激酶或磷酸酯酶活性，但同一种蛋白或不同蛋白中的死亡结构域可以互相结合，通过这种结合将信号下传，从而将死亡受体与配体结合所产生的信号与胞浆事件联系起来。（一）死亡结构域信号转导蛋白的结构与生物学功能n1TRADDTRADD(TNF receptor-associated death domain protein)是一种34kDa的与TNFRI信号转导有关的蛋白质，当TNFRI与配体结合后，受体发生多聚化，受体胞浆区的死亡结构域就可以结合TRADD羧基端的死亡结构域，通过TRADD向下游传递信号。n2FADDFADD(Fas-associated deat
21、h domain protein)是一种23kDa的蛋白，通过其羧基端的死亡结构域（DD）与活化Fas的胞浆区结合。FADD的氨基端的序列被称为死亡效应结构域(death effector domain,DED)。DED象死亡结构域一样也是一种介导蛋白之间相互作用的接头结构域，具有DED结构的蛋白之间可以互相结合起来。现在已经发现了一系列具有DED结构的蛋白质，它们在细胞凋亡的信号传递及调节过程中也都具有一定的作用。n3RIPRIP(receptor-interacting protein)，RIP的分子量为74kDa，它不但可以和Fas结合，还可以通过TRADD间接与TNFRI结合。RIP除
22、了羧基端的死亡结构域外，其氨基端还有一个蛋白激酶同源区(protein kinase homolog,PKH)。RIP的作用还不是很清楚。n4CRADDCRADD(caspase and RIP adaptor with death domain)是一种分布很广泛的胞浆信号蛋白，它的结构很独特，在羧基端有一个可以与RIP结合的死亡结构域，在氨基端则有一个与caspase蛋白酶同源并能与caspase-2作用的结构域。CRADD在细胞中过量表达也可以引起细胞凋亡。n5MADDMADD(MAP kinase-activating death domain protein)是一个与TNFRI胞浆区有
23、关的信号蛋白，它是最长的含有死亡结构域的蛋白，有1588个氨基酸残基，在羧基端也有一个死亡结构域，通过这个结构域与活化的TNFRI结合，并激活胞浆中MAPK和JNK等蛋白激酶，进而活化AP-1、ATF2和ELK-1等转录因子。（二）死亡结构域信号蛋白在死亡受体信号转导中的作用n1死亡结构域信号蛋白介导死亡受体的信号转导n死亡结构域信号蛋白是死亡受体与胞浆成分之间联系的纽带，FADD蛋白一方面通过DD结构域结合Fas胞浆区，另一方面通过DED结构域与下游的caspase蛋白酶结合，从而将膜表面受体与胞浆中细胞凋亡的终末酶联系起来。nTNFRI的凋亡信号也是由FADD介导的，但TNFRI不能直接结
24、合FADD，通过TRADD来与FADD发生联系。n2死亡结构域的结构与功能的关系死亡结构域的相互结合是死亡受体信号转导的关键。对TRADD死亡结构域的系统突变研究分析表明，死亡结构域是作为一个整体介导TRADD与TNFRI的结合的，不能再划分为小的结构单元或基序，所以推测死亡结构域可能具有特定的空间构形。三、caspase蛋白酶家族n最初有关凋亡基因的研究来自一种线虫CE（Caenorhabditis elegans），在其发育过程中，14个基因与CE的体细胞凋亡有关，其中ced-3、ced-4基因参与所有细胞的凋亡。而CED-9可使胚胎发育避免PCD。n在哺乳动物，原癌基因BcL-2和CED
25、-9相关；CED-3与IL-1转化酶（ICE）序列具有相似性；凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1）是CED-4的同源蛋白。Apaf-1是诱导细胞凋亡的一种蛋白。CED-4可活化CED-3。nICE/CED-3蛋白酶的活性是由活性中心的半胱氨酸上的巯基发挥的，所以属于半胱氨酸酶类。n这个家族的蛋白酶具有特异性地在特定的氨基酸序列中将肽链从天门冬氨酸(Asp)之后切断的活性。经过近几年的工作，目前已经从人和动物细胞中克隆到十几种这样的蛋白酶。n1996年Alnemri等提出将人源性的ICE/CED-3蛋白酶统一命名为“天
26、冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶”(cysteinyl aspartate-specific protease,caspase)，并将已经克隆出来的人的ICE蛋白酶依次命名为caspase-1 14，其中ICE为caspase-1。（一）caspase家族的结构与分类n1Caspase分子结构 n未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为p20和p10，活性酶就是由这两种亚基以(p20/p10)2的形式组成的。n这种活化反应也是Asp特异的，剪
27、切发生在Asp与其后的氨基酸残基之间。这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B参与。n2Caspase蛋白酶的分类 n根据Caspase蛋白酶在机体中的作用可分为启动酶（包括Caspase2、Caspase8、Caspase9、Caspase10）、效应酶（包括Caspase3、Caspase6、Caspase7）和ICE（包括Caspase1、Caspase4、Caspase5、Caspase11、Caspase12、Caspase13、Caspase14）三个亚类。（二）ICE亚类caspase蛋白酶n1caspase-1(ICE)
28、nICE即IL-1 转化酶(IL-1 converting enzyme)，是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1前体剪切为17kD的成熟IL-1，这种剪切对于IL-1活性的发挥是必须的。nICE属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。n2caspase-4ncaspase-4基因定位于人染色体11q22.2-22.3，所编码的蛋白包含377aa，分子量约43kD，一级结构与ICE有53%的同源性，在切除104aa的原结构域后同源性更高达60%，所有与酶活性中心(QACRG)和与结合底物有关的氨基酸残
29、基都得到了保留。ncaspase-4分布较广，除脑组织外在所有检测的组织中都有表达。ncaspase-4的活性形式也是由P20和P10两种亚基组成。将caspase-4基因转染Sf9昆虫细胞系可以引起典型的凋亡变化，提示caspase-4在细胞凋亡中起一定的作用。n3caspase-5caspase-5包含418aa，分子量47.7kD，与ICE有51%的同源性，并具有保守的活性中心QACRG。但caspase-5不能剪切pro-IL-1b，在过量表达时可以诱导凋亡的发生。n4caspase-11ncaspase-11表达于许多组织，与ICE表达模式相似，并可以被LPS所诱导。n在Rat-1细
30、胞中过量表达caspase-11可以引起细胞凋亡，CrmA和BcL-2可以阻断这种凋亡。ncaspase-11可以被颗粒酶B剪切并活化。ncaspase-11虽不能剪切IL-1 前体，但可以活化ICE，通过ICE再活化IL-1。所以在细胞凋亡中，caspase-11可能作用于ICE上游，在受LPS刺激后首先活化，然后再通过活化ICE，一方面剪切IL-1，引起炎症反应，另一方面还可以在有些细胞中引起细胞凋亡。（三）启动亚类caspase蛋白酶n起始Caspase(Caspase2、8、10、9)含蛋白质蛋白质相互作用的长N末端结构域，即死亡效应结构域(DED)或CARD(caspase recr
31、uitment domain)，可分别与接头蛋白的同源结构域作用，例如，Caspase9的CARD与Apaf1的CARD结合；Caspase8的DED可与FADD的DED结合。n起始Caspase与接头蛋白结合而聚集，被募集的起始Caspase前体发生构象改变而被激活。激活的起始Caspase随即进行自身切割，并剪切和激活效应Caspase，或通过剪切其他底物(如Bid)而激活线粒体途径。n1caspase-8n（1）caspase-8的结构和分布 n Caspase-8前体共有479aa，分子量为55kD，其显著的特点是在N端有2个70aa左右的结构域，与FADD的N端的死亡效应结构域(de
32、ath effector domain,DED)同源，这种同源的结构域可以发生相互聚合，提供了caspase-8与FADD相互结合的一个部位。ncaspase-8分布于胎儿和成人的各种组织中，但在胎脑中没有分布。在外周血白细胞中水平较高，可能与白细胞的凋亡有关。n（2）caspase-8的活化和参与细胞凋亡 caspase-8可以自我活化，也可以在颗粒酶B的剪切下活化。caspase 8 特异性识别的序列是DEVD，活化的caspase-8不但可以剪切PARP，而且还参与其它ICE家族蛋白酶，如caspase-3和caspase-7的活化过程。n（3）caspase-8参与细胞凋亡的机制 nc
33、aspase-8具有DED结构域，与FADD结合。n在非活化情况下caspase-8的两个DED结构是互相结合在一起的。当细胞膜表面的Fas与FasL结合后，受体发生多聚化，引起FADD与受体胞浆区死亡结构域互相结合。这种结合使FADD的DED结构域发生变构，变构后的DED可以与胞浆中caspase-8的一个DED结构域结合，使caspase-8的两个DED结构域分开，同时使caspase-8的ICE同源区解放出来，恢复蛋白酶活性，通过自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶，后者再作用于胞浆中其它ICE家族蛋白酶，使它们发生逐级活化。n2caspase-2n在细胞发生凋亡时，caspa
34、se-2可通过其原结构域与CRADD结构域结合，并被活化。48kDa的caspase-2首先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14，然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的活性蛋白酶，后一过程要在2 3h后才能完成。ncaspase-2可能参与CTL细胞的杀伤作用，但它并不能被颗粒酶B直接活化，必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。n3caspase-9caspase-9与其它成员有30%左右的同源性，它的原结构域很长，与caspase-3相似。n4caspase-10ncaspase-10含有497aa，分子量55kD，与其它成员有
35、3050%的同源性。ncaspase-10分子结构的显著特点是其N端也有两个FADD氨基端样结构域，所以它也可能与caspase-8一样是将细胞膜事件转化为细胞浆事件的一个环节。ncaspase-10分布广泛，基因定位于2p12。（三）效应亚类的caspase蛋白酶n效应Caspase(Casase3、6、7)含较短或不含结构域,，以无活性的二聚体形式主要存在于胞质中，通过剪切其大、小亚单位间的特异位点被而激活。一旦起始Caspase被激活，随即剪切并激活效应Caspase，后者又可互相进行剪切，以级联反应的方式被激活。最终，激活的效应Caspase切割胞内底物，破坏细胞结构及细胞代谢，导致凋
36、亡的典型生化和形态学变化。n切割核纤层蛋白(lamins)与凋亡细胞染色质浓集、胞核缩小有关；剪切Caspase激活的脱氧核糖核酸内切酶CAD(Caspaseactivated deoxyribonuclease)的抑制物ICAD，导致核酸内切酶释放并进入核内致DNA片段化；剪切细胞骨架蛋白(如肌动蛋白actin)可致细胞片段化，形成小泡样结构及凋亡小体。n凋亡细胞暴露某些吞噬信号（如磷脂酰丝氨酸/或细胞表面糖类变化），即被吞噬细胞所吞噬。n1caspase-3现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。n（1）caspase-3的结
37、构 npro-caspase-3含有277个氨基酸残基，分子量约32kD，与ICE有30%同源性，与CED-3有35%同源，是caspase家族中与CED-3同源性最高的，不论从结构同源性还是从底物特异性来看都与CED-3很相似，所以有人认为它是CED-3在哺乳动物中的同源蛋白。npro-caspase-3在活化过程中从Asp28Ser29和Asp175Ser176两处被剪切，形成p17和p10两个片段，相当于ICE的p20和p10，两种亚基再组成活性形式的caspase-3。n（2）caspase-3的活化和参与细胞凋亡 ncaspase-3可以被多种因素活化，在CTL细胞的杀伤作用中，它既
38、可被Fas/FasL途径活化，也可以通过颗粒酶B途径活化。颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶，是哺乳动物中caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶。n（3）caspase-3引起细胞凋亡的机制 ncaspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARPpoly(ADP-ribose)polymerase，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。n在细胞凋亡启动时，116kD的PARP在Asp216-Gly217之间被caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段，使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能。结果使受PARP负调控
39、影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。n2.caspase-6ncaspase 6与caspase-3有38%同源性，可以在昆虫细胞中引起细胞凋亡。ncaspase 6可以剪切层蛋白B，而且其活性对Zn2+敏感，这是唯一一个可以剪切层蛋白的caspase。caspase识别的序列也是VEID。它不能剪切U1-70K和DNA-PK，但可以部分剪切PARP，并可活化caspase 3。n3.caspase-7ncaspase-7包含304aa，分子量35kDancaspase-7是与caspase-3同源性最高的成员，有58%的同源性，与其它cas
40、pase有35%的同源性。ncaspase-7可以分别在Asp23 Ala24、Asp198 Ser199和Asp206 Ala207之间被剪切，形成P20/P12形式的caspase-7。ncaspase-7分布很广泛，在脑中也有少量存在。n当Fas和TNF引起的细胞凋亡时细胞内caspase-7也被活化。caspase 7不能剪切pro-IL-1，但它可以剪切PARP和固醇调节元件。（四）效应caspase酶引起凋亡的机制n细胞在受到凋亡刺激后数秒钟内即发生caspase蛋白酶的话化，在30 60分钟内即可完成整个细胞凋亡和清除过程，其中包括DNA的片段化、染色质固缩、细胞膜水泡样变、细胞
41、皱缩并向内包裹形成凋亡小体等。caspase蛋白酶是引起这些变化的主要直接因素。n1破坏细胞抗凋亡因素 ncaspase活化后可以激活一种可以剪切DNA的酶，即DNA片段化因子(DNA fragmentation factor，DFF)。DFF也称为caspase激活的DNA酶(caspaseactivated DNase，CAD)，由40kDa和45kDa两条肽链组成。其中45ka肽链，即DFF45，也称ICAD(inhibitor of CAD，CAD抑制物)；而DFF40则是具有DNA酶活性的肽链。n正常情况下DFF40通过其N端的调节性结构域与DFF45结合在一起，并处于失活状态。Ca
42、spase3可以在两个部位剪切和灭活DFF45，并使DFF40释放和活化，通过其破坏DNA的结构。ncaspase还可以剪切凋亡抑制因子bcl2家族的分子，影响抗凋亡作用。n2破坏细胞的结构 ncaspase活化后可以通过剪切核纤层蛋白而破坏核膜的结构。Caspase-6是目前发现的惟一可以剪切核纤层蛋白的caspase蛋白酶。n在细胞凋亡过程中caspase还可以剪切其他与细胞结构有关的蛋白质，如凝溶胶蛋白、FAK(focal adhesion kinase)、PAK2(p21-activated kinase 2)等。凝溶胶蛋白是一种专门剪切肌动蛋白的蛋白酶，在细胞内调节肌动蛋白的排列，从
43、而影响细胞的形态和运动。在正常情况下凝溶胶蛋白的活性受到溶血磷脂酸的负调控，当被caspase剪切后可以产生一个组成性活化的蛋白酶片段，其活性不受控制，因而可以破坏细胞膜的肌动纤维，影响细胞膜的结构。nFAK是一种分布十分广泛的非受体型蛋白酪氨酸激酶，可以结合细胞膜表面的整合素分子，并与整合素分子与细胞外基质的黏附有关。nFAK分子中具有caspase-3、caspase-6和颗粒酶B的酶切位点，当被剪切后，就会通过影响细胞的黏附及其他功能诱导细胞凋亡。nPAK2的剪切与凋亡小体的形成有关。n3影响核酸的结构与功能 ncaspase活化后还剪切和灭活多种与DNA和RNA功能有关的蛋白质，包括P
44、ARP、DNA-PK、U1-70K等。nPARP即多聚(ADP-核糖)聚合酶po1y(ADP-ribose)polymerase是一种与DNA修复、基因完整性监护有关的聚合酶。Caspase-3可以将116kDa的PARP在Asp216-G1y217之间剪切成3lkDa和85kDa两个片段，使PARP分子中DNA结合域与N端的催化区域分离，不能发挥正常功能。结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起DNA断裂。nDNA-PK即DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent Protein kinase)，是一种在真核细胞中广泛分布的丝
45、氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个异源二聚体的DNA结合亚基和一个较大催化亚基组成。可以催化多种转录因子和核内蛋白的磷酸化。Caspase-3可以催化DNA-PK催化亚基的磷酸化，并使之活性增强。活化的DNA-PK可能通过其催化活性促进细胞的凋亡。n凋亡效应亚类的caspase还可以催化多种细胞内蛋白质的裂解，如连锁蛋白、波形纤维蛋白、MEKKl、PKC、PP2A、NF-B、Rb等，这些蛋白质可能都直接或间接地参与了细胞的凋亡以及凋亡细胞的清除。第六节 与凋亡相关的基因n细胞凋亡受遗传的控制。n一类为促进凋亡基因或称细胞死亡基因（cell death genes,Ced），如白细胞介素-1转换酶（I
46、L-1 converting enzyme,ICE）、p53、Fas和c-myc等基因；n另一类为抑制凋亡基因或称细胞死亡抑制基因，如Bcl-2（B-cell lymphoma/leukemia-2）等基因。bcl-2基因的缺失突变将促进PCD的发生。一、BcL-2家族nBcl-2因首先发现于人类B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma/leukemia 2）而得名，随后发现bcl-2可调节细胞凋亡。nBcl-2家族与CED-9同源的蛋白质，它们在结构上具有同源性。Bcl-2家族的蛋白在羧基端具有疏水序列，可以以多聚体形式与细胞内质膜结合，细胞内定位证明它们常位于线粒体和核孔复合体。nBc
47、l-2家族蛋白质的活性形式一般是二聚体。n虽然Bcl-2家族蛋白质具有同源性，但它们的功能并不完全相同，如Bcl-2、Bcl-x可以抑制凋亡，而Bax、Bad可以促进细胞凋亡。(一)BcL-2与Bax调控细胞凋亡n1.Bcl-2抑制细胞凋亡nBcl-2是在B细胞淋巴瘤中发现一种原癌基因，肿瘤的发生是由于Bcl-2的高表达抑制了细胞的凋亡过程。nBcl-2可以抑制多种形式的细胞凋亡，包括糖皮质激素、-射线照射、佛波酯、离子霉素、CD3单抗交联等各种因素引起的细胞凋亡。细胞因子依赖性细胞在细胞因子撤除时发生的凋亡也可以被Bcl-2阻断。Bcl-2也可以作用于IL-4、IL-2、GM-CSF依赖的细
48、胞系以及对NGF依赖的神经元。BCL-2还可以阻断病毒引起的细胞凋亡。nBcl-2通过羧基端19aa的疏水区定位于线粒体膜、滑面内质网和核膜上，其余大部分的肽段暴露于胞浆中。Bcl-2的胞浆中膜定位对其功能的发挥具有重要的作用，失去疏水信号序列的Bcl-2只能部分阻断细胞凋亡。用酵母外膜蛋白Mas70p代替Bcl-2的疏水区，可以使它重新分布于膜上，并恢复其原有的活性。n2.Bax对BcL-2的调节作用Bax(Bcl-2 associated X protein)是一种分布很广泛的Bcl-2家族成员，分子量为21kDa。nBax与Bcl-2一样也具有一个疏水的羧基端，可以与Bcl-2结合成异源
49、二聚体并定位于质膜上。nBax不但可以与Bcl-2形成异源二聚体，也可以自身形成同源二聚体。n与Bax分离的Bcl-2就失去了抗凋亡能力，说明Bcl-2与Bax的结合是Bcl-2发挥作用的前提。n而当Bax在细胞内超表达，并形成同源二聚体时，细胞对死亡信号的反应增强。n所以Bcl-2与Bax的比例，决定了细胞对凋亡信号的反应。(二)Bcl-2家族其它成员n1.BcL-X nBcL-X与BcL-2在氨基酸水平上有44%的同源性，也具有疏水的羧基端跨膜结构域，并可与Bax形成二聚体。nBcl-X有两种形式：一种是BcL-XL，长233aa，含有高度保守的BH1和BH2；BcL-XS则缺少组成BH1
50、和BH2的63aa。Bcl-XL作用与Bcl-2相似，抑制凋亡的发生，而Bcl-XS则可以促进凋亡。n2.BAK nBAK(Bcl-2 homologous antagonist/killer)也具有BH1和BH2同源序列，作用与Bax相似，可以与Bcl-2和Bcl-XL作用，拮抗它们的作用，并促进凋亡进程。nBAK与Bax不同的是它更易于与Bcl-XL结合，而与Bcl-2的结合能力稍差。n3.BAD nBAD(Bcl-2/Bcl-XL-associated death promoter)与其它成员的同源性很低，只在BH1和BH2的关键性氨基酸残基上存在保守性，而且缺乏羧基端疏水性跨膜区，所以
