1、第六章第六章 放线菌遗传放线菌遗传以链霉菌（以链霉菌（Streptomyces）为研）为研究对象，为究对象，为G菌，多细胞、丝状菌，多细胞、丝状细菌。细菌。放线菌遗传学研究历史放线菌遗传学研究历史放线菌遗传学研究历史第一节 链霉菌的染色体一、链霉菌的染色体DNA 天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）在细胞中以致密的拟核状态存在，形成超螺旋区域，并且与蛋白质、RNA结合在一起。在菌丝中以多拷贝形式存在，在孢子中以单拷贝形式存在。几乎所有的链霉菌的染色体都是线性而非环状，只有一条染色体，而且基因内部无内含子。染色体大小为8Mb左右，GC含量为73-75%，重复序列为4-1
2、1%。特征：两末端有24-600kb的反向重复序列（terminal inverted repeat）每个DNA链的5末端都有共价结合蛋白（terminal protein）The replication origin(oriC)is located at the center of the 8-Mb linear chromosome.Identical sequences(27.5 kb in length)named TIRs are found at both ends of the chromosome.The locations of the oriC,TIR,LAdj,Ctrl1
3、,and Ctrl2 probes are marked with arrows below the chromosome.The physical distance between LAdj and TIR is 173bp,and that between Ctrl1 and Ctrl2 is 40 bp.链霉菌线性染色体的复制通过oriC复制原点进行双向复制，末端蛋白作为引物引导染色体末端后随链冈崎片段的合成。二、链霉菌染色体的扩增、缺失和重排 几乎所有链霉菌的染色体都具有高度的遗传不稳定性，经常发生扩增和缺失，从而引起染色体重排。染色体缺失：染色体的部分丢失而导致某些基因的功能丧失。缺
4、失可高达2000kb 染色体扩增：某些染色体DNA序列的拷贝数专一性地大量增加地现象。AUD（amplified unit DNA）：扩增单位，长度为525kb，两侧为12kb地重复序列。ADS（amplified DNA sequence）：扩增的DNA序列，实际扩增的DNA序列，由扩增单位通过串联重复形成。ADS是染色体的重要组成部分，含量可高达30。链霉菌染色体的扩增和缺失自发突变可高达0.11。用溴化乙锭或UV诱导可达101、变铅青链霉菌的氯霉素和精氨酸双突变株（CmlsArg）变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）66和天蓝色链霉菌A3（2）中，位于染色体末端的氯
5、霉素抗性基因染色体缺失（0.5的缺失频率），缺失后，末端重组而环化为环状染色体，形成氯霉素敏感菌株（Cmls）。Cmls菌株不稳定，编码精氨酰琥珀酸合成酶argG（argininosuccinate synthetase）的基因更容易缺失（25的缺失频率），从而形成氯霉素和精氨酸双突变株（CmlsArg）。Streptomyces lividans2、灰色链霉菌染色体缺失使asfA位点丢失A因子是一种细菌激素，对链霉素的产生和孢子的形成起着正调节作用，asfA基因产物是A因子生物合成的关键酶。asfA基因在高温、UV照射或亚硝基胍（NTG）作用下，可高频丢失。用高温和亚硝基胍（NTG）作用下获
6、得asfA突变株404-23和N2。研究表明两个菌株都在染色体左末端和右末端分别发生不同片段长度的缺失，且两突变菌株染色体都可以由于异常重组再环化形成环状染色体，并且在突变株中稳定存在。3、产二素链霉菌（S.ambofaciens）中的缺失突变体遗传性状不稳定，染色体易缺失。3种类型：缺失位于染色体一条臂的近末端，包括TIR序列，染色体呈线性。染色体两端的TIR完全缺失，然后环化成环状染色体，但是环化后并不稳定。缺失发生在染色体的一端，终止在扩增部位，也就是说突变体同时具有缺失和扩增，染色体线性。4、不产色链霉菌红迪变种（S.achromongenes subsp.rubradiris）的染色
7、体扩增 不产色链霉菌红迪变种的野生型菌株有一个8.0kb的AUD序列，含有链霉素弱抗性基因，在扩增突变体中有200300个拷贝的AUD串联重复形成的扩增区域（ADS），对链霉素有较强抗性。在无选择压力下，ADS依然存在，突变株很快失去形成孢子或原生质体的能力。链霉菌属染色体的高度不稳定性，表明高度遗传变异不是致病的，能被细菌很好忍耐下来，并稳定与染色体共存。缺失和扩增是链霉菌中的普遍现象 不稳定结构基因常与染色体的扩增单位AUD相连，而且容易缺失丢掉，在ADS附近缺失终止。链霉菌染色体重排的类型：线性染色体两个末端都发生缺失，缺失末端重组后环化形成环状DNA。缺失和扩增都发生在染色体的一个末端
8、，另一个末端保持完整，染色体保持线性。在染色体内部大范围缺失，两个末端仍保持完整。第二节 链霉菌中的质粒、转座子和噬菌体一、链霉菌中的质粒1、链霉菌中质粒类型 大多数链霉菌含有质粒，几乎都是自主转移质粒，在接合中起重要作用。（1）线性质粒 在DNA两端具有TIR和5末端蛋白SCP1（2）环状质粒 有些链霉菌的质粒像噬菌体一样具有int和xis基因，当进行接合时，能够特异性的整合到宿主高度保守的tRNA基因中。2、质粒与致死接合反应自然条件下，链霉菌的遗传重组主要通过自主转移质粒介导的接合作用而进行的。大多数链霉菌的自主转移质粒具有致死接合反应的特征，在表型上产生“麻点”（Pock），即将含有自
9、主转移质粒的菌株接种到不含该质粒的菌株的菌落上，可产生类似噬菌斑的环状晕圈现象。麻点的形成时由于自主转移质粒从供体菌转移到受体菌，导致受体菌暂时发育迟缓而造成的。3、链霉菌中几种重要的自主转移质粒链霉菌中几种重要的自主转移质粒 链霉菌中与接合作用有关的质粒的体积一般都较小，大多数链霉菌的质粒的接合效率达100。（1）天蓝色链霉菌SCPl质粒 1971年，首次发现SCPl质粒控制着寄主天蓝色链霉菌的致育性，是巨大质粒，难分离。SCPl是线性、双链DNA、长363kb的巨大质粒，携带次甲基霉素的生物合成基因。质粒DNA两端有长末端反向重复序列（TIR）。左末端重复序列（TIR-L）和右末端重复序列
10、(TIR-R)长度均为80kb,而且TIR-R内侧含有插入因子IS466。SCP1容易形成球拍框架（racket frame)结构，是由染色体DNA的反向重复序列区域组成，是TIR及其结合蛋白的相互作用的结果。SCP1SCP1质粒具有下列特征：编码几种与产孢有关的蛋白质。携带合成次甲基霉素的基因簇。在天蓝色链霉菌中有下列几种存在形式：n自主复制质粒（SCPl）n整合到寄主染色体上的整合型（SCP1-NF）n带有染色体片段的自主复制质粒（SCPl-cysB和SCPl-argAuraB）。(2)天蓝色链霉菌SCP2质粒 1975年发现，是天蓝色链霉菌中的第二种致育质粒。SCP2是31kb、共价、闭
11、合的环状双链DNA。SCP2*是SCP2的高致育突变体，引起的重组率可高达10-3。SCP2*或SCP2在每个细胞的拷贝数是1-2个，能稳定遗传。经过一个“孢子-孢子”循环后，99.5%子代孢子都保留SCP2质粒。SCP2*或SCP2质粒可稳定遗传，能促进染色体从供体向受体的转移。改造后的SCP2*作为链霉菌的克隆载体和链霉菌与大肠杆菌间的穿梭载体而被广泛应用。Restriction map of SCP2*.(3)变铅青链霉菌pIJ 101质粒 pIJ101是变铅青链霉菌中大小为8.9kb，拷贝数高达300个的环状质粒，属于自主转移质粒，能以很高的频率转移到受体菌中。质粒携带的6个基因与质粒
12、的转移和麻点的形成有关。kilA和kilB是致死基因，与质粒的接合致死反应有关，这两个基因突变，则不能形成麻点。korA和korB是致死抑制基因（kill override），抑制致死基因kilA和kilB的过量表达。tra(transfer)基因负责质粒在菌丝间的转移，spd（spead)基因负责质粒在菌丝内的转移。kilA、kilB、tra、spd这四个基因与质粒的转移和致死接合反应有关，korA和korB对kilA和kilB的作用进行调控。麻点的形成是质粒转移至受体细胞后，由于kil基因的暂时表达而使细胞生长受到抑制的结果。对链霉菌属质粒的tra基因负责质粒在菌丝间的转移，而spd基因负
13、责质粒在菌丝内的转移和麻点的形成。(4)变铅青链霉菌SLP2质粒 质粒SLP2是变铅青链霉菌66的一个重要的接合质粒，线性，长度为50kb，属于低拷贝质粒。SLP2可在种间进行转移，在天蓝色链霉菌和S.paevulus中的转移率分别是：7-38%和4%-59%，SLP2能促进染色体的转移，而SLP3却不能带动染色体的转移。The secondary structures formed by 3single-stranded DNA spanning the 10 terminal palindromes with the lowest energy level was constructed
14、based on energy opti-mization using the DNA Fold server,and G:A sheared pairings at the hairpin loops and at the GAA:GAA motifs(Huang et al.,1998).The Roman numerals indicate the palindrome numbers.The hairpin loop sequences that are homologous to the first hairpin sequence at the 3 end of the parvo
15、viral genome are shaded in black.The proposed G:A sheared pairings are indicated by bold typeface and solid dots.Predicated secondary structures of the terminal sequence of the S.lividans chromosome and SLP2 plasmid.4.线性质粒和线状染色体的复制和转移(1)、TP作为引物引导DNA复制 线性质粒的两个共同特征：线性DNA的两个末端具有反向重复序列；DNA的5端结合着末端蛋白。娄彻链
16、霉菌（Srochei)的pSLA2质粒，通过位于质粒DNA中央的复制起点进行双向复制，在3端留下280bp的单链空隙，然后靠TP作为引物进行复制而补齐。天蓝色链霉菌的染色体也是从oriC开始进行双向复制，可能在3端留下的单链空隙，也是依靠TP作为引物而完成复制。起始阶段。病毒编码的p6蛋白和p17蛋白与复制起点结合形成蛋白一核酸复合物，使双链DNA的末端解螺旋，产生单链区。一分子游离的TP与特异的DNA聚合酶结合形成TP-DNA聚合酶复合物，然后TP-DNA聚合酶复合物识别复制起点并与之结合。接着DNA聚合酶催化TP蛋白的丝氨酸残基上的OH基团与dAMP共价结合。延伸阶段。DNA复制起始后，在
17、相同的DNA聚合酶的作用下，通过“链弃置机理”（strand-displacement mechanism)进行DNA链的延伸，即合成新链的同时使带有TP的亲本链游离出来，单链结合蛋白p5结合在被弃置的母链上，同时起始蛋白从DNA链上脱离下来。复制是连续进行的，没有冈崎片段的出现。在DNA一端起始合成后，另一端也以同样的方式开始复制，形成所谓的typeII复制中间体，即全长的双链DNA,并带有1个或2个单链分枝。当复制继续进行，两个复制叉相遇时，Type I复制中间体在空间上相互分开，形成2个Type II复制中间体。每个TypeI复制中间体，都具有全长DNA,并且起始合成的一端是双链DNA,
18、尚未完成复制的另一端是单链DNA.终止阶段。随着单链结合蛋白p5从单链DNA上的移去，复制继续进行到DNA的另一端，完成复制。一旦合成全长双链DNA分子，DNA聚合酶就会与另一个TP结合，开始新一轮DNA复制。Model for initiation of in vivo 29 DNA replication.For simplicity,only one 29 DNA end(replication origin)is represented.Viral DNA replication would start with the assembly of a protein p1-based s
19、tructure on the bacterial membrane.This structure would provide an anchoring site for the viral replisome,constituted at least by the primer TP29 DNA polymerase heterodimer.The membrane-associated replisome would further interact with the replication origins,located at both ends of the parental 29 T
20、PDNA molecule.This stage is activated by the viral protein p6,which forms a multimeric nucleoprotein complex at the replication origins.This activation requires specific recognition of the protein p6 nucleoprotein complex by the primer TP 29 DNA polymerase heterodimer(Freire et al.,1996).Protein p6
21、is absolutely required for 29 DNA replication in vivo(Carrascosa et al.,1976;Mellado et al.,1980).The EMBO Journal(2000)19,55755584（2）线性质粒和线性染色体的接合转移的比较 在放线菌中，线性质粒和线性染色体的接合转移方式可能与F质粒的方式类似。结合着末端蛋白TP的DNA的5端作为转移起点（oriT）。在转移起点处，TP作为引物起始DNA的复制，被弃置的带有TP的亲本链开始向受体细胞转移，其过程类似于F/Hfr转移。二、链霉菌中的转座因子 链霉菌中的转座因子包括插入
22、序列、转座子和可转座的噬菌体。目前发现的转座因子都不含天然选择标记，有的位于染色体上，有的位于质粒上。三、链霉菌中的噬菌体 链霉菌中既有温和性噬菌体也有烈性噬菌体，有些噬菌体的寄主范围窄，而有些噬菌体的寄主范围广泛。由于链霉菌属于土壤细菌，因此链霉菌的噬菌体最容易从土壤中分离而得到。已经从很多链霉菌中分离到噬菌体，如天蓝色链霉菌中的C31噬菌体、委内瑞拉链霉菌（S.venezuelae）中的SVl噬菌体、龟裂链霉菌中的RP2和RP3噬菌体。C31是链霉菌的广寄主范围的温和噬菌体，在形态和其他特征上与大肠杆菌a噬菌体类似。C31既能溶源又能裂解，噬菌体通过att位点整合到宿主染色体的特异位点上而
23、形成原噬菌体。其DNA长度为41.4kb，G+C含量为63，具有粘性末端。第三节 链霉菌的接合作用 链霉菌间的遗传重组主要通过质粒介导的接合作用进行。一、链霉菌基因重组的证实1955年塞蒙梯(Sermonti)夫妇首先发现天蓝色链霉菌可通过遗传重组交换产生重组体。将两个不同的营养缺陷型菌株混合培养，使基质菌丝相融合。一个菌丝的部分染色体通过菌丝间的连接而进人另一菌丝形成局部杂合核。局部杂合核在分裂过程中发生染色体交换和减数，在同一菌丝体上形成各种单倍重组体孢子。由一个杂合核演化繁殖形成的菌落叫异质系克隆(heteroclone)。由异质系克隆产生的抱子大多不能在基本培养基上生长，采用不同的选择
24、性培养基可以鉴别出不同类型的单倍重组体。异质系是放线菌基因重组所特有的现象。在部分合子（半合子）中的重组 Recombination between an intact linear chromosome(left)and a partial chromosome with a telomere(right).Both odd numbers(shown)and even numbers of crossover are legitimate,generating recombinant chromosomes with mixed ends or the same ends,respecti
25、vely.Recombination between an intact linear chromosome(left)and an internal chromosomal sequence(right).Even-numbered crossovers are necessary to give rise to a complete recombinant chromosome.在部分合子（半合子）中的重组Recombination in merozygotesRecombination between intact chromosomes（染色体间的重组）Recombination be
26、tween two linear chromosomes with free ends.Both odd and even numbers of crossovers are allowed,giving rise to mixed ends or the same ends,respectively.Recombination between intact chromosomes（染色体间的重组）Recombination between two intact linear chromosomes with strongly interacting telomeres.Even number
27、s of crossovers are necessary for separation of the recombinant+-+-chromosomes.Two pairs of terminally located alleles,a/a and z/z,are indicated to illustrate linkage analysis.The TPs are represented by the filled circles.二、天蓝色链霉菌中的性别体制和遗传重组与链霉菌育性有关的质粒：SCP1、SCP2和SCP2*1、天蓝色链霉菌A3(2)的性别体制 SCP1是在链霉菌中发现的
28、第一个与遗传重组有关的性因子。控制着天蓝色链霉菌的各种致育状态。UF(超致育型，Ultrafertility）：不含SCP1质粒的菌株IF(原始致育型，Initial Fertility）：携带SCP1质粒的菌株NF(正常致育型，Normal Fertility）：SCP1整合在寄主染色体上的菌株育性杂交（与F质粒比较）天蓝色链霉菌的三种致育类型与大肠杆菌的三种致育类型类似，但是二者之间也有区别。UFUF可以得到少数重组子（可育，也可能是其他育性质粒引起）（FF不育）NFNF 高度可育（FF，HfrHfr 不育）IfUF IF、NFUF NF(FF F，HfrFF-）2、SCP1和SCP2（或
29、SCP2）相互作用SCPl与SCP2（或SCP2）属于两种不同的致育因子，在质粒转移方面是独立的，即SCPl的转移不依赖于SCP2的作用，反之也同理。在致育性方面，它们的作用也是独立的，相互之间无干扰作用。当SCPl和SCP2或SCP2共同存在时，在促进染色体重组方面的作用是累加的3、携带相同质粒的两个菌株之间的遗传重组 许多链霉菌天然携带自主转移质粒，突变所衍生的菌株在进行杂交时常以相当高的频率（10-610-1)产生重组子。有些菌株之间的重组频率较低（10-6），由于质粒“进人劣势（entry disadvantage）”来解释，即当参加杂交的两个亲本都带有一种相同的质粒时，重组的频率就非
30、常低；当只有一个亲本带有这种质粒时，重组率就会提高。4、天蓝色链霉菌NF菌株的形成及杂交特征(1)天蓝色链霉菌NF菌株的形成 NF菌株是SCP1整合到染色体上后而形成的。天蓝色链霉菌典型的SCP1-NF菌株：2612,A317和A332 SCP1整合在染色体9 oclock位置，SCP1能带动染色体从供体细胞向受体细胞进行双向转移。SCP1的左末端（TIR-L）完整而右末端（TIR-R）发生缺失。SCP1质粒含有插入因子IS466，天蓝色链霉菌染色体含有IS466和其他插入因子。NF菌株形成是SCP1以球拍框架结构整合在染色体上，为了保持其稳定性，SCP1质粒上的IS466和染色体上的IS46
31、6之间的重组，使SCP1的一端发生缺失。非典型的SCP1-NF菌株：A608和A634SCP1两端都发生至少4kb的缺失。很可能是在典型菌株2612基础上，两端进一步缺失后形成的。(2）天蓝色链霉菌NF X SCP1杂交的特征 NF菌株在接合过程能带动染色体基因以高频率双向转移(大肠杆菌Hfr菌株的单向转移)。在NF菌株中，SCPI整合在环状染色体的9 oclock位置，当与SCPI一杂交时，供体的标记基因被双向梯度转移到受体中。由于断裂的位置不方将出现顺时针和逆时针两个方向的转移，在转移过程中两个方向都随时发生断裂，每个SCPI一细胞得到NF不同的片段，愈靠近转移起点的标记转移几率越高，愈远
32、则愈低，因而形成梯度。三、链霉菌的遗传分析方法和基因连锁图的制作1、4x4杂交”方法（four-on-four cross)2、异质系克隆（heteroclone)3、平板杂交1、4x4杂交”方法（four-on-four cross)孢子：ade his十 孢子：arg lys 接种于完全培养基中，25下培养3-4天。形成孢子后，把单位体积的孢子悬浮液涂布在下列4种选择性培养基上：腺嘌吟精氨酸腺嘌岭十赖氨酸精氨酸十组氨酸组氨酸赖氨酸。每种培养基上所长出的菌落（全部或抽样）就可参照于那种培养基上的非选择性标记而归类。每一种培养基上即可有4种可能的基因型。根据培养基上的菌落总数，就可计算出单位体
33、积中每个基因型的数目 1、4x4杂交”方法（four-on-four cross)2、异质系克隆（heteroclone)异质系克隆是指在某些放线菌中，两个多重标记的营养缺陷型亲本杂交时，供体染色体片段进人受体细胞后形成的局部杂合核在分裂过程中发生染色体交换和减数，结果在同一菌丝体上形成各种单倍重组体孢子，这样由一个杂合核演化繁殖形成的菌落叫异质系克隆（hetero-clone）。异质系克隆产生的孢子是重组子和亲本基因型的总和。异质系克隆产生的孢子大多不能在基本培养基上生长，采用不同的选择性培养基可以鉴别出不同类型的单倍重组体，根据其频率就可用来做链霉菌的遗传图谱。3、平板杂交 当要将许多菌株
34、与同一个亲本进行杂交，以测定染色体重组或质粒转移的频率时，“平板杂交技术”就很适用。步骤：是把长有一系列待测菌株的母平板影印到接种有同一亲本且已长成孢子“坪”的非选择培养基（完全培养基或凡YE）平板上进行杂交。杂交平板长好孢子后，再影印到一种或多种选择培养基上，回收重组子。四、链霉菌与大肠杆菌之间的接合作用 通过大肠杆菌进行接合作用时，首先人工构建能在大肠杆菌和链霉菌中都能进行复制的双功能载体（即穿梭载体），接着将外源基因连接在载体上，然后通过大肠杆菌与链霉菌间的接合作用，就可将外源基因导人链霉菌。载体一般是含有革兰阴性菌质粒RP4的oriT位点的可移动质粒，利用大肠杆菌供体提供的转移功能，能介导大肠杆菌和链霉菌杂交。第四节第四节 链霉菌的转化和原生质体融合链霉菌的转化和原生质体融合 一、原生质体融合 将两个亲本株分别用酶法脱去细胞壁，在高渗介质中形成由细胞膜包裹的原生质体。等量相混，在聚乙二醇（PEG）存在下诱导融合，经过DNA交换、重组而产生重组子，再生细胞壁回复成细胞形态。在最适条件下，种内融合重组子的数量可达非选择性再生菌落的20%，种间融合重组率一般为10-5-10-6。原生质体融合包括种内、种间融合重组。应用：紧密连锁的遗传标记基因做图 构建重组菌株二、转化和转染1质粒或噬菌体DNA通过原生质体进行转化或转染 2.电转化
