1、蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。l早在早在18781878年，思格斯就在年，思格斯就在反杜林论反杜林论中指出：中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。的自我更新。”l可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就
2、是的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。l现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断的论断。木瓜蛋白酶（组织蛋白酶）木瓜蛋白酶（组织蛋白酶）v蛋白质是一类含氮有机化合物蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：l 碳碳 5
3、050l 氢氢 7 7l 氧氧 2323l 氮氮 16%16%l 硫硫 0 03 3l 其他其他 微微 量量v氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数由于大多数蛋白质的含氮量接近于蛋白质的含氮量接近于16%16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：v蛋白质含量（克蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含每克生物样品中含氮的克数氮的克数 6.25 6.25l蛋白质是分子量很大的生物分子。对任蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽
4、链的长度在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。白质。l蛋白质分子量的上下限是人为蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。分子量概念的定义。l某些蛋白质是由两个或更多个某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基蛋白质亚基(多肽链多肽链)通过非共价通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。百万甚至数千万。蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可
5、以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解完全水解，酶水解一般是部分水解.多肽是由氨基酸以酰胺键形式连接而成的线性多肽是由氨基酸以酰胺键形式连接而成的线性大分子。它在生物体内可以单独存在，但是更大分子。它在生物体内可以单独存在，但是更多的则是作为蛋白质的组成部分多的则是作为蛋白质的组成部分。蛋白质是由。蛋白质是由一个或多个多肽链通过共价键（主要是二硫键）一个或多个多肽链通过共价键（主要是二硫键）或非共价力结合而成。应用化学或物理方法，或非共价力结合而成。应用化学或物理方法，可以将蛋白质拆分成多肽组分。可以将蛋白质拆分成多肽组
6、分。完全水解得到各种氨基酸的混合物，部完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。种氨基酸的混合物。所以，所以，氨基酸氨基酸是蛋白质的是蛋白质的基本结构单元基本结构单元。大多数的蛋白质都是由大多数的蛋白质都是由2020种氨基酸组成。种氨基酸组成。这这2020种氨基酸被称为种氨基酸被称为基本氨基酸。基本氨基酸。l常用常用6 mol/L6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸在的硫酸在105-110105-110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约2020小时。小时。l此法的优点是不
7、容易引起水解产物的消此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是旋化。缺点是色氨酸色氨酸被沸酸完全破坏；被沸酸完全破坏；l含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。侧链的酰胺基被水解成了羧基。l一般用一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。小时。l由于水解过程中许多氨基酸都受到不同由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。程度的破坏，产率不高。l部分的水解部分的水解产物发生消旋化产物发生消旋化。l该法的优点是该法的
8、优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。l目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolyticproteolytic enzyme enzyme）或称蛋白酶）或称蛋白酶（proteinaseproteinase）已有十多种。）已有十多种。l应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的会发生消旋化。水解的产物为较小的肽肽段。段。l最常见的蛋白水解酶有以下几种：最常见的蛋白水解酶有以下几种：lTrypsin ：R R1 1=赖氨赖氨酸酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg侧链（专一性较
9、强，侧链（专一性较强，水解速度快）。水解速度快）。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶l或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：）：R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe,色氨酸色氨酸TrpTrp,酪氨酸酪氨酸TyrTyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，蛋氨酸蛋氨酸MetMet和组氨和组氨酸酸HisHis水解稍慢。水解稍慢。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶lPepsin：R1R1和和R2R2R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe,色氨酸色氨酸Tr
10、pTrp,酪氨酪氨酸酸TyrTyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu以及其它疏水以及其它疏水性氨基酸水解速度性氨基酸水解速度较快较快。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶lthermolysin)：R2=R2=苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe,色氨酸色氨酸TrpTrp,酪氨酸酪氨酸TyrTyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，异亮氨酸，异亮氨酸IleuIleu,蛋氨酸蛋氨酸MetMet以及其它疏水性强的氨基以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。酸水解速度较快。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点嗜热菌
11、蛋白酶嗜热菌蛋白酶l分别从肽链羧基分别从肽链羧基端和氨基端水解端和氨基端水解NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶l除甘氨酸外，氨基酸除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性均含有一个手性-碳碳原子，因此都具有旋原子，因此都具有旋光性光性。比旋光度是氨比旋光度是氨基酸的重要物理常数基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据基酸的重要依据 l构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基种氨基酸在可见光区都没有光酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区吸收，但在远紫外区(220(97%97%以上）；以上）；l2 2
12、，知道蛋白质的分子量；，知道蛋白质的分子量；l3 3，知道蛋白质由几个亚基组成；，知道蛋白质由几个亚基组成；l4 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。分子量计算每种氨基酸的个数。l5 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。含量。1,1,测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求l(1)，多肽链的拆分多肽链的拆分。l由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。l(1)，多肽链的拆分多肽链的拆分。l几条多肽链借助非共价键连接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为
13、四聚称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用体，烯醇化酶为二聚体；可用8 8mol/Lmol/L尿尿素或素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽盐酸胍处理，即可分开多肽链链(亚基亚基).).l(2)，测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目。l通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。链的数目。l(3)，l几条多肽链通过二硫键交联在一起。可几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用在可用8 8mol/Lmol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/
14、L盐酸胍存在盐酸胍存在下，下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，使二硫巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。生成的巯基，以防止它重新被氧化。l可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。1作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClO-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2ClCH2-OOCCHCH2SNH3+ICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+l(4)(4)测定测定每
15、条多肽每条多肽链的氨基链的氨基酸组成，酸组成，并计算出并计算出氨基酸成氨基酸成分的分子分的分子比；比；l(5)(5)分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端。末端。l多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)(amino-terminal)和和C-C-端氨基酸。端氨基酸。l在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。lSanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。l在酸性条件下水解，得到
16、黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸l在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。l此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到可以达到1 1 1010-9-9molmol。N(C
17、H3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸l此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸l氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的
18、N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。l根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。l最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。l羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出端逐个的水解。根基不同
19、的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。l目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。l羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。l(6)(6)多肽链断裂成多个肽段
20、，可采用两多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。分离开来。l 酶解法酶解法:l胰蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶l 化学法：化学法：(Cyanogen bromide)l溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。基所形成的肽键。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2C
21、HNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯l(7)(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。lEdman Edman（苯异硫氰酸酯法）（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际氨基酸顺序分析法实际上也是一种上也是一种N-N-端分析法。此法的特点是能够不断重端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链复循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解端氨基酸残基逐一进行标记和解离。离。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHO
22、CR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。的氨基酸顺序。(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置。l一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，的多肽链，l再利用双向电泳技术分离出各个肽段，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，及顺序分析，l然后同其它方
23、法分析的肽段进行比较，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。确定二硫键的位置。l蛋白质的二级蛋白质的二级(Secondary)(Secondary)结结构是指肽链的主链在空间的排构是指肽链的主链在空间的排列列,或规则的几何走向、旋转或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。构象及链内或链间形成的氢键。l主要有主要有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转转角。角。l在在-螺旋中肽平面的键长和键角一定；螺旋中肽平面的键长和键角一定；l肽键的原子排列呈反式构型；肽键的原子排列呈反式构型；l相邻的肽平面构成两面角；相邻的肽平面构成两面
24、角；CONCN+O-CNCOHCl多肽链中的各个肽平面围绕多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为即螺距为0.54nm,0.54nm,含含3.63.6个氨个氨基酸残基；两个氨基酸之间基酸残基；两个氨基酸之间的距离为的距离为0.150.15nm;nm;l肽链内形成氢键，氢键的取肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的基酸残基的酰胺基团的-COCO基与第四个氨基酸残基酰胺基与第四个氨基酸残基酰胺基团的基团的-NH-NH基形成氢键。基形成氢键。l蛋白质分子为
25、右手蛋白质分子为右手-螺旋。螺旋。l-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象肽链的主链呈锯齿桩折叠构象l在在-折叠中，折叠中，-碳原子总是处于折叠的角碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的上，氨基酸的R R基团处于折叠的棱角上并与基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.350.35nmnm；l-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形
26、成。几乎所也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。接近垂直。l-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的的N-N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。两条肽链的方向相反。l在在-转角部分，由四个转角部分，由四个氨基酸残基组成氨基酸残基组成;l弯曲处的第一个氨基酸弯曲处的第一个氨基酸残基的残基的 -C=O-C=O 和第四个和第四个残基的残基的 N-H N-H 之间形成之间形成氢键，形成一个不很稳氢键，
27、形成一个不很稳定的环状结构。定的环状结构。l这类结构主要存在于球这类结构主要存在于球状蛋白分子中。状蛋白分子中。l蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。内的特征三维结构。l维系这种特定结构的力主要有氢键、疏维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作水
28、键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。用。l蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。作用关系。l这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位或亚单位Subunit，它一般由一条肽链构成，它一般由一条肽链构成，无生理活性；无生理活性；l维持亚基之间的化学键主要是疏水
29、力。维持亚基之间的化学键主要是疏水力。l由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；白；l蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时也有等电点。在等电点时(Isoelectric Isoelectric point pIpoint pI)，蛋白质的溶解度最小，在电，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。场中不移动。l在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；粒子带负电荷，在电
30、场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳象称为蛋白质电泳(ElectrophoresisElectrophoresis)。l蛋白质在等蛋白质在等电点电点pHpH条件条件下，不发生下，不发生电泳现象。电泳现象。利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。l由于蛋白质的分子量很大，它在水中能由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、
31、布郎溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。运动等。l由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。分子杂质除去。l蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。大小、所带的电荷和水化作用有关。l改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质性质l在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。沉淀出来。l在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电或电荷状
32、况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。离。l在沉淀过程中，结构和性质都没有发生在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。沉淀。l可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。剂沉淀法等。l在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和
33、性质，产生的蛋白质沉淀不质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。可能再重新溶解于水。l由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。质的变化，所以又称为变性沉淀。l如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。l蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现
34、象称为并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)。l变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。激烈的搅拌以及强酸和强碱等。l大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。l这三种氨基酸
35、的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近附近显示强的吸收。显示强的吸收。l利用这个性质，可以对蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。鉴定。l(1)(1)依据蛋白质的外形分类依据蛋白质的外形分类l按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。l球状蛋白质：球状蛋白质：globular proteinglobular protein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。l纤维状蛋白质纤维状蛋白质：fibrous proteinfibrous pr
36、otein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质不溶性纤维状蛋白质。l按照蛋白质的组成，可以分为按照蛋白质的组成，可以分为l简单蛋白简单蛋白(simple protein)(simple protein)l和结合蛋白和结合蛋白(conjugated protein)conjugated protein)。l又称为单纯蛋白质；又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由这类蛋白质只含由-氨基酸组成氨基酸组成的肽链的肽链，不含其它成分。，不含其它成分。l1 1，清蛋白和球蛋白：，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于广泛存在于动物
37、组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。溶于稀酸中。l2 2，谷蛋白，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70708080乙醇中。乙醇中。l3 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。l4 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。中，分为角蛋白、胶原
38、蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。l由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，l色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。l糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。膜中的糖蛋白等。l脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血如血清清-，-脂蛋白等。脂蛋白等。l核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。核中的核糖核蛋白等。l1 1纤维
39、状蛋白纤维状蛋白 l 纤维状蛋白质纤维状蛋白质(fibrous protein)(fibrous protein)广泛地分广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外保护成分，本支架和外保护成分，占脊推动物体内蛋白占脊推动物体内蛋白质总量的一半成一半以上。质总量的一半成一半以上。l这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴长轴短轴)大于大于1()(1()(小于：小于：1010的为球状蛋白的为球状蛋白质质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肤。分子是有规则的线型结构，这与其多肤链的有规则二级结构
40、有关，而有规则的线型二链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。l 纤维状蛋白质可分为不溶性纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白硬蛋白)和和可溶性二类，前者有角蛋白、胶原蛋白可溶性二类，前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；和弹性蛋白等；l后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管包括微管(microtubule)(microtubule)、肌动蛋白细丝、肌动蛋白细丝(actinactin filament)filament)或鞭毛或鞭毛(flagella)(flagella)，它们是球状蛋白
41、质的长向聚集体它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)aggregate)。l角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是角蛋白中主要的是-角蛋白。角蛋白。l-角蛋白主要由角蛋白主要由-螺旋构象的多肽链组成。一螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手般是由三条右手-螺旋肽链形成一个原纤维，螺旋肽链形成一个原纤维，原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性性l例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由例如毛的纤维是由
42、多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。的蛋白质。l-角蛋白的伸缩性能很好，当角蛋白的伸缩性能很好，当-角蛋白被过度角蛋白被过度-拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时-角蛋白转变成角蛋白转变成-折叠结构，称为折叠结构，称为-角蛋白。角蛋白。l 一根毛发周围是一层鳞状一根毛发周围是一层鳞状细胞细胞(scaIescaIe cell)cell)，中间，中间为皮层细胞为皮层细胞(cortical cortical celIcelI)。皮层细胞横截面。皮层细胞横截面直径约为直径约为2020 m
43、m。在这些细。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有所以一根毛发具有高度有序的结构。序的结构。l毛发性能就决定于毛发性能就决定于 螺螺旋结构以及这样的组织方旋结构以及这样的组织方式。式。l永久性卷发永久性卷发(烫发烫发)是一项生物化学工程是一项生物化学工程(biochemical engineering),biochemical engineering),角蛋白在湿角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为热条件下可以伸展转变为 构象，但在冷却构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。干燥时又可自发地恢复原状。l这是因为这是因为 角蛋白的侧链角蛋白的侧链R R基一般
44、都比较大，基一般都比较大，不适于处在不适于处在 构象状态，此外构象状态，此外 角蛋白中的角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺螺旋构象旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。基础。l丝心蛋白丝心蛋白(fibroin)(fibroin)这是蚕这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能质地柔软的特性，但不能拉伸。它具有拉伸。它具有0.7nm0.7nm周期，周
45、期，这与这与 角蛋白在湿热中角蛋白在湿热中伸展后形成的伸展后形成的 角蛋白很角蛋白很相似相似(0.65nm(0.65nm周期周期)。丝心。丝心蛋白是典型的反平行式公蛋白是典型的反平行式公折叠片，多肽链取锯齿状折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向折叠构象，酰胺基的取向使相邻的使相邻的C C 为侧链腾出空为侧链腾出空间，从而避免了任何空间间，从而避免了任何空间位阻。在这种结构中，侧位阻。在这种结构中，侧链交替地分布在折叠片的链交替地分布在折叠片的两侧。两侧。l丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向成反向-折叠结构。分子中不含折叠结构。分子中不含-螺旋
46、。螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：而成。这六肽的氨基酸顺序为：l -（Gly-Ser-Gly-Ala-GlyGly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala）n n-l 骨骼肌以及很多非肌肉细胞含有两种形成特有的纤维状或骨骼肌以及很多非肌肉细胞含有两种形成特有的纤维状或丝状结构的蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白。按生物功能来说丝状结构的蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白。按生物功能来说它们不是基本的结构蛋白质，它们参与需能的收缩活动。它们不是基本的结构蛋白质，它们参与需能的收缩活动。l肌球蛋白是一种很长的捧状分子，有两条彼此缠绕
47、的肌球蛋白是一种很长的捧状分子，有两条彼此缠绕的“螺螺旋肽链的尾巴和一个复杂的旋肽链的尾巴和一个复杂的“头头”。它的总分子量为。它的总分子量为450000450000，约约160nm160nm长，实际上含有六条肽链。长，实际上含有六条肽链。l长尾巴是由二条分子量各为长尾巴是由二条分子量各为200000200000的肽链组成，这两条肽链的肽链组成，这两条肽链称为重链称为重链(heavy chain H(heavy chain H链链)。重链具有柔软的可转动铰链。重链具有柔软的可转动铰链。l头是球形的，含有重链的末端和四条轻链头是球形的，含有重链的末端和四条轻链(light chain(light
48、 chain，L L链链)，其中两条称作，其中两条称作L2L2，分子量为，分子量为1800018000，另外两条称为，另外两条称为LlLl和和L3,L3,分子量分别为分子量分别为1600016000和和2500025000。肌球蛋白分子的头部具有。肌球蛋白分子的头部具有酶活性，催化酶活性，催化ATPATP水解成水解成ADPADP和磷酸，并释放能量。许多肌球和磷酸，并释放能量。许多肌球蛋白分子装配在一起形成骨骼肌的粗丝蛋白分子装配在一起形成骨骼肌的粗丝(thick filament)(thick filament)。肌球蛋白也存在于非肌肉细胞内。肌球蛋白也存在于非肌肉细胞内。l胶原蛋白或称胶原胶
49、原蛋白或称胶原(collagen)(collagen)是很多脊椎动物和无是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，它也属于结构脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，它也属于结构蛋白质，使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度。胶蛋白质，使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度。胶原蛋白至少包括四种类型，称胶原蛋白原蛋白至少包括四种类型，称胶原蛋白I I、H H、HIHI和和IVIV。下面主要讨论胶原蛋白。下面主要讨论胶原蛋白I I。l腱的胶原纤维具有很高的抗张强度腱的胶原纤维具有很高的抗张强度(tensile(tensile strength)strength)，约为，约为20-30kg20-30kgmm2
50、mm2，相当于相当于1212号冷号冷拉钢丝的拉力。拉钢丝的拉力。l骨铬中的胶原纤维为骨骼提供基质，在它的周围排骨铬中的胶原纤维为骨骼提供基质，在它的周围排列着经磷灰石列着经磷灰石(hydroxyapatitehydroxyapatite)磷酸钙聚合物磷酸钙聚合物Ca10(PO4)6(OH)2Ca10(PO4)6(OH)2结晶。脊椎动物的皮肤含有编织结晶。脊椎动物的皮肤含有编织比较疏松，向各个方向伸展的胶原纤维。血管亦含比较疏松，向各个方向伸展的胶原纤维。血管亦含有胶原纤维。有胶原纤维。l胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本组成单位是原胶原蛋白分子
