1、环境消毒监测与验证环境消毒监测与验证 我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。黎巴嫩 纪伯伦（18831931）心得：心得：第一部分：洁净区清洁与消毒 表面擦拭 手工喷雾 蒸汽熏蒸（热过程）干雾消毒、灭菌（冷处理）房间消毒的方法 一种效果非常好的洁净房间的消毒方式。在越来越“以人为本”和“环境保护”的今天，应该格外关注“甲醛”和“臭氧”等气体消毒剂的不良影响。熏蒸 熏蒸（fumigating）灭菌概念：这一标准于1980起收录于USP，如今已为世界各国普遍接受和采用。在一定温度和压力的密闭条件下，化学毒剂由固态或液态迅速转成气态渗透到生物体内，使生物致死。熏蒸有助于降低洁净区内死角的微生物
2、污染。熏蒸消毒：消毒灭菌时间：12小时接触时间（通常推荐）。排气、通风时间：24小时。一个漫长过程。甲醛熏蒸：概述：甲醛是一种灭菌剂，对所有的微生物都有杀灭作用，包括细菌繁殖体、芽孢、真菌和病毒。适用范围：可用于对湿、热敏感、易腐蚀的医疗用品的灭菌。注意事项 (5)甲醛有致癌作用，不宜用于室内空气消毒。甲醛熏蒸：甲醛熏蒸：卫生部：消毒技术规范卫生部：消毒技术规范 2002 杀菌彻底，广谱 可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并可 破坏肉毒杆菌毒素。对霉菌也有极强的杀灭作用。无残留，是一种无污染的消毒剂。臭氧是气体灭菌，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角。臭氧灭菌 空气消毒：用于无人的情况下
3、，室 内空气 的消毒。卫生部：消毒技术规范卫生部：消毒技术规范 2002 注意事项 (1)臭氧对人有毒，国家规定大气中允许浓度为 0.2mg/m3。(2)臭氧为强氧化剂，对多种物品有损坏，浓度 越高对物品损害越重，可使铜片出现绿色锈 斑、橡胶老化，变色，弹性降低，以致变脆、橡胶老化，变色，弹性降低，以致变脆、断裂，断裂，使织物漂白褪色等。使用时应注意。(3)多种因素可影响臭氧的杀菌作用，包括温度、相对湿度、有机物、pH、水的浑浊度、水的 色度等。使用时应加以控制。臭氧熏蒸：卫生部：消毒技术规范卫生部：消毒技术规范 2002常见的化学消毒剂：1）醇类：使蛋白质变性。如75%酒精用于皮肤和容器表面
4、消毒；10%丙二醇用于熏蒸消毒。（2）酚类：损害细菌的细胞壁和细胞质膜。如苯酚一般使用浓度为0.5-3%，甲苯酚为2-5%。（3）醛类：如37-40%甲醛液8-9ml/立方米，加4-5g高锰酸钾用于熏蒸，并密闭12-24小时；2%戊二醛用于熏蒸消毒。（4）酸类：如10%的乳酸用于熏蒸消毒。（5）氧化剂：作用于细菌酶系统。如0.2-0.5%过氧乙酸、高锰酸钾、过氧化氢和臭氧等。（6）表面活性剂：作用于细菌质膜，主要用于表面消毒、浸润消毒和手消毒等。如0.1-0.2%新洁尔灭、0.05-0.1%杜灭芬、0.1-0.2%洗必泰。消毒剂：过氧化氢和过氧乙酸 消毒方式：干雾消毒系统介绍一种消毒剂和消毒方
5、式干雾：小液滴会反弹不会破碎。限度和可接受标准制定原则：消毒剂：过氧化氢和过氧乙酸用于霉菌和酵母菌取样。（4）酸类：如10%的乳酸用于熏蒸消毒。反弹离开表面使用的记录，包括日期及使用时间。（3）醛类：如37-40%甲醛液8-9ml/立方米，加4-5g高锰酸钾用于熏蒸，并密闭12-24小时；作为TAMC计数的一部分。概述：甲醛是一种灭菌剂，对所有的微生物都有杀灭作用，包括细菌繁殖体、芽孢、真菌和病毒。3)残留溶剂限度标准用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。空间
6、分布均匀，符合布朗运动原理。原则：目检不得有可见残留。不湿润接触的表面1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被取样面积：不小于20cm2。大液滴破碎而湿滑表面。第一部分：洁净区清洁与消毒适用范围：可用于对湿、热敏感、易腐蚀的医疗用品的灭菌。生产7.5 m的液滴 像气体性质 反弹离开表面 不湿润接触的表面 空间分布均匀，符合布朗运动原理。干雾系统 洁净区生物负荷研究（风险分析）洁净区操作人员行为的规范规范洁净区操作人员的行为是维持洁净区平衡不可或缺的！洁净区洁净度平衡的维持第二部分：洁净室环境监测 细菌数：在细菌培养基上菌落形成单位的平均数。真菌数：在真菌培养基上菌落形成单位的平均数。微生物总
7、数=细菌数+真菌数微生物总数细菌、真菌培养基：中国药典欧洲药典细菌营养琼脂3035 3天TSA3035 5天霉菌、酵母菌玫瑰红钠琼脂2328 5天SDA2025 5天酵母菌酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂2328 5天/采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30 35 培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20 25 培养箱中培养，时间不少于5d。GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010 细菌培养基上生长的真菌如何计数？真菌培养基上生长的细菌如何计数？微生物计数的困惑！定义：在TSA（大豆酪蛋白琼脂）培养基上 生长的包括真
8、菌的菌落形成单位总的 数量。培养温度/时间：1、细菌：3035 5天。2、细菌：3035 2天；霉菌或酵母菌：2025 3天。总好氧微生物数（TAMC）：定义：在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上 生长的包括细菌的菌落形成单位总的 数量。培养温度/时间：2025 5天。酵母菌和霉菌总数（TYMC）：1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被 作为TAMC计数的一部分。2、TYMC时，如果细菌被发现生长，应该被 作为TYMC计数的一部分。3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受 标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。计数原则：1、残留物如何确定？非专属的方法可以用于原料药生产的早期阶段，或者作
9、为日常监控的手段。3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受4、日常监控如何实施？我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。3、分析方法如何验证？用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。允许残留物总量（g/cm2）=参见：“中国药典”2010年版 附录109页第二部分：洁净室环境监测MTDD=每次给药数X活性成分含量X每日最少给药次数3)残留溶剂限度标准臭氧是气体灭菌，能迅速弥漫到整个灭菌空间，采样时培养基表面应与采样点接触不少于10s，向整个接触表面施加恒定
10、均匀的压力（如施加的质量约为25g/cm2），不得有环形或线性运动，装置有接触并拿开后，要加盖并尽快用适当的培养条件培养。能够消除洗必泰类消毒剂的影响。洁净环境微生物检测：方法确认素的关联性的进行评价。验证项目包括专属性、准确度、精密度、线性、范围、耐用性、检测限和定量限。洁净室环境监测培养基的选择？（关键区域使用培养基的特殊要求）洁净区微生物监测的动态标准洁净区微生物监测的动态标准（GMP2011版）版）洁净度级别浮游菌cfu/m3沉降菌（90mm）cfu/4小时表面微生物接触（55mm）cfu/碟5指手套cfu/手套A级1111B级10555C级1005025D级20010050CHP20
11、10中国药典2010年版 二部 附录附录XIX XIX Q Q“药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则”用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。附录B:B.3 培养基平皿培养及保存 制备好的培养基平皿宜在28保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜的方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期的标记。GB/T 16293-2010/GB/T 16293-20101、TSA 用于细菌取样。培养温度/时间：3035 不少于2天。2、SDA 用
12、于霉菌和酵母菌取样。培养温度/时间：2025 不少于5天。环境测试培养基：3、用户认可并验证了的培养基。以上摘自：GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010环境测试培养基：1、忽视洁净环境中的影响因素2、忽视培养基的选择环境监测中常忽视的两个方面：（1）API 的残留（2）消毒剂/杀孢子剂的残留1、忽视洁净环境中的影响因素 抗菌素 药物活性成分API非专属的方法可以用于原料药生产的早期阶段，或者作为日常监控的手段。卫生部：消毒技术规范 2002斑、橡胶老化，变色，弹性降低，以致变脆、取样方法、分析方法、残留限度、棉签回收MTDD X 最小生产批量 X 1000黎巴嫩 纪伯伦
13、（18831931）1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被反弹离开表面1、残留物如何确定？用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。消毒方式：干雾消毒系统允许残留物总量（g/cm2）=大液滴破碎而湿滑表面。标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。消毒方式：干雾消毒系统用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端
14、灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。素的关联性的进行评价。MTDD X 最小生产批量 X 1000对霉菌也有极强的杀灭作用。消毒剂/杀孢子剂常见的化学消毒剂：1、酚类2、醛类3、过氧化氢类4、季胺盐类化合物5、以上混合物（1）选择性低下，营养全面（2）含有中和剂（3）“无菌”平板培养基2、忽视培养基的选择 营养琼脂 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基的选择参见：“中国药典”2010年版 附录109页附录XI J 表1：“常见干扰物中和剂或灭活方法”中和剂的使用：青霉素酶（-内酰胺酶）可以有效的水解-内酰胺类抗生
15、素。包括：-青霉素G -氨基青霉素类，如氨苄西林、阿莫西林、匹氨西等 -羧基青霉素类，如羧苄西林、替卡西林等 -脲基青霉素类，如呋苄西林、美洛西林等 -头孢、酶（1）：青霉素酶 头孢菌素酶 可以有效水解头孢类抗生素及以上的头孢类 抗生素。包括：头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢呋辛、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松等。酶（2）：头孢菌素酶抵抗消毒剂的中和剂：1、吐温、吐温-80 能够消除六氯酚和含汞类消毒剂的影响。2、卵磷脂、卵磷脂 能够消除洗必泰类消毒剂的影响。3、卵磷脂、吐温、卵磷脂、吐温-80 能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎 氯铵等）消毒剂的影响。无菌平板培养基 （预灌装无
16、菌培养基）理想的环境测试培养基：1、A级、B级、C级洁净区直接使用2、室温储存3、有效期长4、无菌包装、包装完整5、特制平板6、培养基灌装量大无菌平板培养基优点：55mm接触平板（Rodac Plate）Replicate Organism Detection and Counting GMP2011和和 EU GMP:-平板尺寸：15 X 55 mm -取样单位面积：25cm2 洁净环境微生物检测：方法确认（3）“无菌”平板培养基4、日常监控如何实施？卫生部：消毒技术规范 2002内空气 的消毒。2%戊二醛用于熏蒸消毒。辅料残留物（非水溶性）3)残留溶剂限度标准可用于清洗的化学溶剂(三级溶剂
17、)在下批生产中允许的溶剂残留小于初始溶液浓度的0.非专属的方法可以用于原料药生产的早期阶段，或者作为日常监控的手段。参见：“中国药典”2010年版 附录109页干雾消毒、灭菌（冷处理）内空气 的消毒。小液滴会反弹不会破碎。5%过氧乙酸、高锰酸钾、过氧化氢和臭氧等。总好氧微生物数（TAMC）：微生物样品的检测和分析：API、过滤介质残留（如果有）接触板的取样面积：2430cm2 USP1116 洁净室和其它控制环境的微生物评估 取样面积：不小于20cm2。取样方法：采样时培养基表面应与采样点接触不少于10s，向整个接触表面施加恒定均匀的压力（如施加的质量约为25g/cm2），不得有环形或线性运动
18、，装置有接触并拿开后，要加盖并尽快用适当的培养条件培养。ISO 14698 洁净室及其相关控制环境 目前各类官方的指导原则中，很少有对洁净环境微生物监测方法提出要求的。目前各类官方的指导原则中，各种微生物只有生长在如下两种固体表面上的测试方法：琼脂培养基和滤膜，才能够得到确认。洁净环境微生物检测：方法确认 培养基就是微生物检验员的“分析仪器”。培养基的质量控制相当于“培养基验证”。培养基 =“分析仪器”TSA TSA+吐温80+卵磷脂 TSA+酶关键区域环境监测培养基：第三部分：设备清洁第一百四十三条 清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使
19、用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。GMP 2011年版：1、没有定期对设备和器具进行清洁与维护，有可能造成污染，并对药品的安全性、鉴 别特性、浓度/效价、质量和纯度造成影 响。FDA关于设备洁净“警告信”统计：2、生产中所用的设备（包括器具）的清洁维 护没有建立完善的规程。FDA关于设备洁净“警告信”统计：微生物样品的检测和分析：（4）酸类：如10%的乳酸用于熏蒸消毒。反应物残留、中间产物残留、过滤介质残留-定性检测，染色、鉴别污染菌是否是控制菌。可用于清洗的化学溶剂(三级溶剂)在下批生产中允许的溶剂残留小于初
20、始溶液浓度的0.API、过滤介质残留（如果有）10 X 10-6专属的方法只能检测到其关心的残留物，其他的残留物不会被检测到。我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。限度规格制定的三个层面：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）PDA技术报告：1998增刊52卷 第6号3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受对霉菌也有极强的杀灭作用。适用范围：可用于对湿、热敏感、易腐蚀的医疗用品的灭菌。适用范围：可用于对湿、热敏感、易腐蚀的医疗用品的灭菌。真菌数：在真菌培养基上菌落形成单位的平均数。可以有效的水解-内酰胺类抗生素。微生物总数=细菌数+真菌数-定性检测，染色、鉴别污染菌是否是控制菌。3、没有保存药品生
21、产中所用设备的维护、清 洁、消毒和检查记录，无设备清洁、维护 使用的记录，包括日期及使用时间。FDA关于设备洁净“警告信”统计：活性成分残留 辅料残留物（非水溶性）清洁剂和溶剂残留 生物细胞及代谢物残留 微生物 润滑油残留物分类：制剂残留关注点：残留关注 通则 制剂API、过滤介质残留（如果有）微生物、清洁剂、润滑剂。原料药 反应物残留、中间产物残留、过滤介质残留 中药溶解度最小、颜色最深 生物制剂细胞、代谢产物1、实际的2、可以被验证的3、可实现的4、能够经得起科学推敲的限度和可接受标准制定原则：PDA技术报告：1998增刊52卷 第6号1、目检（肉眼检测）2、化学检验3、微生物检验限度规格
22、制定的三个层面：原则：目检不得有可见残留。是直观、定性、简单评估清洁的方式 经验数据：目见能发现最低的残留物 限度是14g/cm2 这是换品种生产时设备清洁的最低标准！1、肉眼检测限度：该种方法不适用于高效、低剂量的产品。1)残留物浓度限度：10 X 10-62)生物活性度：正常治疗剂量的1/10003)残留溶剂限度标准2、化学检验残留物限度的确定*10 X 10-6*含义：上批产品残留在设备里的物质全 部溶解到下批产品中的浓度限度 10 X 10-6*检测：最终冲洗水中残留物的浓度限度 10 X 10-6（1）残留物浓度限度 正常治疗剂量的1/1000 含义：最低日治疗剂量（MTDD）的1/
23、1000 检测：MTDD=每次给药数X活性成分含量X每日最少给药次数允许残留物总量（g/cm2）=MTDD X 最小生产批量 X 1000 单个制剂质量X每日最多使用制剂数X设备内表面积（2）生物活性度（安全系数）：可用于清洗的化学溶剂(三级溶剂)在下批生产中允许的溶剂残留小于初始溶液浓度的0.5%。（3）残留溶剂限度标准：特殊产品，如致敏性产品（青霉素、头孢类）或高活性产品在使用最好的检测手段的前提下，不应被检出。实际上意味着对于这类产品需要采用专用生产设施。特殊产品的限度：分析方法、取样方法、以及残留限度的关系取样方法、分析方法、残留限度、棉签回收率或其它取样工具的回收率。必须对以上因素的
24、关联性的进行评价。设备清洗的正确评价：专属的方法只能检测到其关心的残留物，其他的残留物不会被检测到。活性成分专属的清洁效果检测方法，可能只能检测到单一的活性成分残留物。制剂生产的清洁验证都要用专属的测试方法进行检测。（1）专属性的分析方法 非专属的方法将能够检测到许多不同的残留物。非专属的方法可以用于原料药生产的早期阶段，或者作为日常监控的手段。非专属方法的主要优点是这类方法非常容易实施、具备高的灵敏度、不需要繁琐的样品制备。（2）非专属性的分析方法专属性分析方法 VS 非专属性分析方法专属性分析方法非专属性分析方法近红外分光光度法高效液相色谱法红外光谱法原子吸收光谱仪毛细管电泳仪酶联免疫吸附
25、测定法总有机碳测定仪pH计滴定法电导重量分析法 检验方法进行方法学验证。验证项目包括专属性、准确度、精密度、线性、范围、耐用性、检测限和定量限。方法学验证：（3）醛类：如37-40%甲醛液8-9ml/立方米，加4-5g高锰酸钾用于熏蒸，并密闭12-24小时；反弹离开表面允许残留物总量（g/cm2）=4、日常监控如何实施？非专属的方法可以用于原料药生产的早期阶段，或者作为日常监控的手段。实际上意味着对于这类产品需要采用专用生产设施。洁净区生物负荷研究（风险分析）干雾消毒、灭菌（冷处理）含义：上批产品残留在设备里的物质全第一部分：洁净区清洁与消毒微生物总数=细菌数+真菌数数量。培养温度/时间：3035 不少于2天。API、过滤介质残留（如果有）允许残留物总量（g/cm2）=（3）“无菌”平板培养基洁净环境微生物检测：方法确认能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎（3）醛类：如37-40%甲醛液8-9ml/立方米，加4-5g高锰酸钾用于熏蒸，并密闭12-24小时；专属的方法只能检测到其关心的残留物，其他的残留物不会被检测到。取样：无菌棉签、无菌平板培养基或冲洗水。检测 -定量检测，建立警戒线和行动线；-定性检测，染色、鉴别污染菌是否是控制菌。无菌制剂应当关注细菌内毒素的检测。微生物样品的检测和分析：自动清洗程序 半自动化清洁 手工清洁清洁效果日常确认
