1、第四章第四章 种子的扩大培养种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备的技术概要 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种过程。这些纯种培养物称为种子。第一节 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念:种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵
2、时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染无杂菌污染第一节第一节 种子制备过程举例种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵1、斜面、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点
3、：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次2.一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%，硫酸镁，硫酸镁0.04%pH7.0培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所
4、使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基一级种子质量要求一级种子质量要求种龄：种龄：12h pH值：值：6.4 0.1 光密度：净增光密度：净增OD值值0.5以上以上残糖：残糖：0.5以下以下 无菌检查：无菌检查：(-)噬菌体检查：噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应革兰氏阳性反应3.二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡
5、萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基通风量通风量:50L种子罐种子罐1:0.5,搅拌转速搅拌转速340rmin；250L种子罐种子罐1:0.3,搅拌转速搅拌转速300r min 500L种子罐种子罐1:0.25,搅拌转速搅拌转速230r min种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛无菌检查无菌检查二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管
6、 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵1、斜面孢子、斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天,注意湿度注意湿度50%左右左右2、大米孢子、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培养条
7、件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨4、二级种子、二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%三、啤酒酵母的扩大培养三、啤酒酵母的扩大培养三级扩大培养三级扩大培养扩大倍数：第扩大倍数：第1级到第级到第2级为级为8-10倍倍 第第2级到第级到第3级为级为4-6倍倍 1，
8、实验室扩大培养，实验室扩大培养2，车间扩大培养，车间扩大培养从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种接种方式：接种方式：从种子罐接种：从种子罐接种：种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为年青期，为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强第二节第二节 种子制备的技术概要种子制备的技术概要一、种子制备的过程一、种子制备的过程实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验不用种子罐
9、，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。二、实验室阶段二、实验室阶段1、培养物选择的原则、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特
10、点最终的培养物可分为两类：的培养物可分为两类：q 对于不产孢子和芽胞的微生物对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。养。获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定
11、数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。例：放线菌孢子的制备例：放线菌孢子的制备采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。白胨和一些无机盐等。培养温度一般为培养温度一般为28C。培养时间为培养时间为514天天。2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）试管试管三角瓶三角瓶卡式罐卡式罐种子罐种子罐 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌链霉素的灰色链霉
12、菌、产卡那霉素的卡那链霉菌可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。丝体，作为种子。试管试管三角瓶三角瓶摇床摇床种子罐种子罐 2、培养基选择的原则、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较因此为了
13、保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。精细。3、起始接种物的传代问题、起始接种物的传代问题q 细菌细菌保藏斜面保藏斜面 活化斜面活化斜面q 产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 子斜面子斜面目的目的：使菌种的传代次数尽可能的少。：使菌种的传代次数尽可能的少。母瓶母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子瓶子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。大量繁殖，得到大量孢子。接种：接种：从母斜面上点接种，选取生长好的从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落单菌落 接种时密一点
14、，得到大量的孢子。接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月个月孢子培养三、生产车间阶段三、生产车间阶段1、培养物的选择原则、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。q 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：2、培养基选择的原则、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和
15、菌体的生长，所首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本一是成本 二是驯化二是驯化例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵q 以蔗糖为原料以蔗糖为原料成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 蔗糖蔗糖 2.5-5%20%NH4NO3 0.225%0.11%K2HPO4 0.03%MgSO4.H2O 0.025%0.025%KCl 0.015%琼脂琼脂 2%q 薯
16、干粉薯干粉成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 薯干粉薯干粉 10%22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂琼脂 2%3、发酵级数的确定、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子（小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子（小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模
17、、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般般2-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面的一个方面细菌：二级发酵细菌：二级发酵 茄子瓶茄子瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 霉菌：如青霉菌，三级发酵霉菌：如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液孢子悬浮液一级种子罐（一级种子罐（27C,40小时孢子发小时孢子发芽）芽）二级种子罐（二级种子罐（27C,1024小时）小时）发酵罐发酵罐 放线菌：四级发酵放线菌：四级发酵酵母
18、：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 常用微生物发酵级数：常用微生物发酵级数：4、接种量的确定、接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，以实践定，如大多数抗生素为过大过小都不好，以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。通常接种量：细菌通常接种量：细菌15%，酵母菌，酵母菌510%，霉菌霉菌715%，有时，有时2025%双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于
19、发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。5、种龄、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。大，但是最终由实验结果定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，蛋白酶，12小时最好。小时最好。6、种子的质量要求：、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度量：要求达到一定的浓度质质:形态形态（
20、生长处于某个阶段、均匀等等）（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：理化指标：C、N、P的含量，的含量，pH，产物生成量，产物生成量 酶活等酶活等 无污染无污染单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。种子异常分析种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团菌丝结团 菌丝粘壁菌丝粘壁 本章小节：了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念理解种子扩培的目的和要求掌握控制种子质量的基本方法和手段
