1、一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具3.3.种类：种类：质粒、质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒质粒质粒二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序获取目的基因获取目的基因构建表达载体构建表达载体导入受体细胞导入受体细胞目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。称为基因文库。受体菌包含了某种生
2、物所有的基因，该受体菌群受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。体称为这种生物的基因组文库。受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如为这种生物的部分基因文库，如cDNAcDNA文库。文库。提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNADNA片段）片段）mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链D
3、NADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物cDNA文库文库 PCR是聚合酶链式反应（是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用它是利用DNA 双链复制的原理，将基双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指指数方式数方式增加。因为整个过程是在增加。因为整个过程是在体外体外进行，所以进行，所以又叫做又叫做体外体外DNA扩增技术扩增技术。高温变性高温变性(DNA解旋解旋)（9095）低温退火低温退火(引物结合引物结合)（5560）中温延伸中温延伸(互补链
4、合成互补链合成)（7075）p 双链双链DNADNA是在高温条件下解链为单链是在高温条件下解链为单链DNADNA的，因此整个的，因此整个过程不需要解旋酶。过程不需要解旋酶。多次多次重复重复推推测测推推测测合合成成DNA合成仪合成仪 用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成连接形成重组重组DNA分子分子，即，即基因表达载体基因表达载体。质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接
5、酶重组重组DNA 使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且，并且可遗传可遗传给下给下一代，同时，使目的基因能够一代，同时，使目的基因能够表达表达和和发挥作用发挥作用。（1 1）目的基因）目的基因（2 2）启动子）启动子 RNARNA聚合酶识别聚合酶识别和结合的一段特殊结构的和结合的一段特殊结构的DNADNA片段，位于基因的首端，片段，位于基因的首端，RNARNA聚合酶与之结合才能驱动基因聚合酶与之结合才能驱动基因转录出转录出mRNAmRNA，进而获得需要的，进而获得需要的蛋白质。蛋白质。（3 3）终止子）终止子 一段特殊结构一段特殊结构的的DNADNA片段，位于基因的
6、尾端，片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地作用是使转录在所需要的地方停止。方停止。（4 4）标记基因）标记基因 鉴别受体细胞鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。有目的基因的细胞筛选出来。(5)(5)复制原点复制原点 将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为定和表达的过程称为转化转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒
7、侵染细导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法（2 2）其他方法）其他方法l 基因枪法基因枪法l 花粉管通道法花粉管通道法移移 植植显微显微注射注射分裂分裂分化分化发发育育(显微注射技术显微注射技术)含目的基因含目的基因的表达载体的表达载体动动 物物 的的受受 精精 卵卵含目的基因含目的基因的受精卵的受精卵早早 期期胚胚 胎胎雌性动物输卵雌性动物输卵管或子宫管或子宫转基因转基因动动 物物l 制备感受态细胞：用制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细）处理细菌，使细菌易于
8、接受外源菌易于接受外源DNA分子。分子。l 重组重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。(Ca(Ca2+2+处理法处理法)目的基因目的基因是否真正插入受体细胞的是否真正插入受体细胞的DNA中，中，是否能是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、，只有通过检测、鉴定才能得知。鉴定才能得知。常用的检测手段主要从常用的检测手段主要从分子水平分子水平和和个体水平个体水平进行。进行。适当限制适当限制酶切割酶切割用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交提取受体生提取受体生物全部物全部DNA许多许多DN
9、A片片段段显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）（分子杂交技术）（分子杂交技术）提取受体生提取受体生物的物的mRNA用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已转录出了（表明目的基因已转录出了mRNA）检测检测DNA利用的是利用的是DNA与与DNA杂交，检测杂交，检测mRNA利用的是利用的是DNA与与mRNA杂交。杂交。（分子杂交技术）（分子杂交技术）（抗原（抗原抗体杂交技术）抗体杂交技术）提取受体生提取受体生物的蛋白质物的蛋白质与相应抗体杂交与相应抗体杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（
10、表明目的基因已形成蛋白质产品）（分子杂交技术）（分子杂交技术）例：例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述 不正确的是不正确的是（）A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒 B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达导入大肠
11、杆菌的目的基因不一定能成功表达 C.DNA连接酶和连接酶和 RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒 C2.下列关于基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（下列关于基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（）A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性内切酶的活性受温度的影响限制性内切酶的活性受温度的影响C.限制性内切酶能识别和切割限制性内切酶能识别和切割RNAD.限制性内切酶可从原核生物中提
12、取限制性内切酶可从原核生物中提取C含重组质粒含重组质粒土壤农杆菌土壤农杆菌抗虫基因抗虫基因含含kan质粒质粒重组质粒重组质粒A构建构建土壤农杆菌土壤农杆菌导入导入B培养选择培养选择侵侵 染染转基因转基因抗虫植株抗虫植株离体棉花离体棉花叶片组织叶片组织愈伤组织愈伤组织C诱导选择诱导选择再生植株再生植株分化分化D检测检测3.3.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kankanr r）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。那霉素培养基上
13、生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：请据图回答：（1 1）A A过程需要的酶有过程需要的酶有_。（2 2）B B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是 _。（3 3）C C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加 入入_。（4 4）如果利用）如果利用DNADNA分子杂交原理对再生植株进行检测，分子杂交原理对再生植株进行检测，D D过程应该用过程应该用 _ _ _ _ _作为探针。作为探针。限制性内切酶和限制性内切酶和DNA连接酶连接酶具有标记基因；能在
14、宿主细胞内复制并稳定保存具有标记基因；能在宿主细胞内复制并稳定保存卡那霉素卡那霉素放射性同位素（或荧光分子）标记后的抗虫基因放射性同位素（或荧光分子）标记后的抗虫基因（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔 遗传规律。遗传规律。将转基因植株与将转基因植株与_杂交，其后代中抗卡那杂交，其后代中抗卡那 霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型 的数量比为的数量比为_。若将该转基
15、因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得 的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。含重组质粒含重组质粒土壤农杆菌土壤农杆菌抗虫基因抗虫基因含含knar质粒质粒重组质粒重组质粒A构建构建土壤农杆菌土壤农杆菌导入导入B培养选择培养选择侵侵 染染转基因转基因抗虫植株抗虫植株离体棉花离体棉花叶片组织叶片组织愈伤组织愈伤组织C诱导选择诱导选择再生植株再生植株分化分化D检测检测非转基因植株非转基因植株3：1100三、基因工程的应用三、基因工程的应用如如 转基因抗虫棉（水稻）转基因抗虫棉（水稻）(减轻农药对环
16、境的污染减轻农药对环境的污染)抗病毒（细菌、真菌）转基因植物，抗病毒（细菌、真菌）转基因植物，如如 抗病毒转基因小麦、抗病毒转基因小麦、抗病毒转基因烟草等抗病毒转基因烟草等如如 转鱼抗冻蛋白基因番茄、转鱼抗冻蛋白基因番茄、转基因抗除草剂玉米转基因抗除草剂玉米如如 富含赖氨酸的转基因玉米、富含赖氨酸的转基因玉米、转基因延熟番茄转基因延熟番茄三、基因工程的应用三、基因工程的应用如如 转生长激素基因鲤鱼转生长激素基因鲤鱼如如 低乳糖转基因牛（转肠乳糖低乳糖转基因牛（转肠乳糖酶基因）酶基因）如如 乳腺生物反应器乳腺生物反应器利用基因工程利用基因工程改造供体器官改造供体器官，抑制或去抑制或去除除供体器官
17、供体器官抗原决定基因的表达抗原决定基因的表达，获得，获得没有免疫排斥反应没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官的转基因克隆猪器官三、基因工程的应用三、基因工程的应用利用基因工程技术，通过利用基因工程技术，通过微生物微生物生产蛋白质类药品。生产蛋白质类药品。三、基因工程的应用三、基因工程的应用 基因治疗就是将基因治疗就是将正常基因正常基因导入病人体内，使该导入病人体内，使该基因的基因的表达产物发挥功能表达产物发挥功能，从而，从而达到治疗疾病达到治疗疾病的目的目的。基因治疗是治疗遗传病最有效的手段。的。基因治疗是治疗遗传病最有效的手段。从病人体内获得某种细胞，进行培养，在从病人体内获得某种细胞，进行培
18、养，在体外体外完完成成基因转移基因转移，筛选筛选成功转移的细胞成功转移的细胞扩增培养扩增培养，再，再重新重新输入输入患者体内的治疗方法。患者体内的治疗方法。直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。SCID的基因工程治疗的基因工程治疗四、蛋白质工程四、蛋白质工程 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过为基础，通过基因修饰基因修饰或或基因合成基因合成，对，对现有现有蛋白质进行蛋白质进行改造改造，或，或制造一种新的蛋白质制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生，以满足人类对生产和生活的需求。活的需求。四、蛋白质工程四、蛋白质工程（一）原理（一）原理（二）过程（二）过程基因基因DNA生物功能生物功能预期功能预期功能mRNA转录转录氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链翻译翻译蛋白质蛋白质三维结构三维结构折叠折叠DNA合成合成分子设计分子设计中心法则的逆推中心法则的逆推
