1、实验二、实验二、 蛋白质定量分析蛋白质定量分析 蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定；蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用：现实应用： 1. 临床检测临床检测血清蛋白浓度测定；血清蛋白浓度测定； 2. 科学研究科学研究纯化蛋白的浓度测定；纯化蛋白的浓度测定； 主要方法主要方法 根据蛋白质元素组成根据蛋白质元素组成凯氏定氮法；凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法根据蛋白质组成特点建立的比色法双缩脲双缩脲 法，法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA 法；法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法；根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法；
2、双缩脲法 一、实验原理双缩脲反应 OH- 蓝色蓝色 紫红色紫红色 在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比1-10mg； 蛋白质的双缩脲反应蛋白质的双缩脲反应 Cu2+ OH- 测定蛋白质范围：1-10mg/ml 选用波长：540nm 仪器：VIS-7220、UV5200 缺点：灵敏度较差，特异性不高 实验步骤 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管 测定管 空白管 试剂 蛋白质标准液蛋白质标准液10mg/ml 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCl （ml） 0.8 0.6 0.
3、4 0.2 1.0 双缩脲试剂双缩脲试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 37水浴水浴20min，540nm比色，空白管调零比色，空白管调零 由于单色光透过溶液时，不仅被由于单色光透过溶液时，不仅被待测物质待测物质所吸收，而所吸收，而 且还被且还被比色容器与溶剂比色容器与溶剂以及以及其它试剂其它试剂吸收一部分，这吸收一部分，这 部分需用空白管消除；部分需用空白管消除； 空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而不含被空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而不含被 测定的物质。测定的物质。 空白管空白管 标准曲线法测定蛋白质浓度 （一）标准曲线作用 判断所采用的呈
4、色方法是否符合Lamber-Beer定 律 判断测定过程中操作、仪器等误差的大小，确 定该方法的可靠性 从斜率可以比较各种方法的灵敏度 进行大批样品分析时，可省略多次计算，从 OD值直接查阅标准曲线求得被测物质浓度 标准曲线制作标准曲线制作 根据Lambert-Beer定律，定律， A与与C成正比成正比 配制一系列标准液配制一系列标准液 C1、C2、C3， 在在 max下，测相应的下，测相应的 A1、A2、A3。 y = 0.912x R2 = 0.8836 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 00.10.20.30.40.50.6 C(mg/ml) A AX CX 仪器: max:
5、日期: 室温: 图1：XXXXX 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 Tyr Trp 1. 蛋白质分子中含有共轭双键的蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸芳香族氨基酸。 它们具有吸收紫外光的性质。它们具有吸收紫外光的性质。 2. 其最高吸收峰在其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内波长处，且在此波长内 吸收峰的光密度值与其浓度成正比。吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 3. 由于各种蛋白质的由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸酪氨酸和色氨酸的含量不同，的含量不同， 因而要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能因而要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能 进行准确定量。进行准确定量。 核酸的最大吸收峰在2
6、60nm，可能发生干 扰，须同时测定OD260与OD280，根据 两种波长OD的比值，通过经验公式校正， 以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真 实含量。 测定蛋白质范围：0.1-1mg/ml 选用波长：260nm 280nm 仪器：UV-9200、UV5200、UV-2000 优点：操作简便，纯化蛋白质的微量测 定 缺点：核酸干扰，精确度差 实验步骤 样品(ml) 测定管 空白管 待测血清样本 0.4 生理盐水 3.6 4.0 紫外法测定蛋白质浓度须采用标有H字样的石英杯 操作：不做标准曲线，只测空白管和测定管 计算：利用经验公式直接计算 OD280/OD2601.5时 样本浓度(mg/ml)=1.45OD280-0.75OD260 OD280/OD2601.5时 样本浓度(mg/ml)=(OD280/6.31) 10g/L 双缩脲法测定蛋白质浓度 1 2 3 4 5 6 7 A/OD A/OD 260 280 280/260 紫外法测定蛋白质浓度 C
