1、第13章 体外单倍体诱导与单倍体育种1植物单倍体诱导途径:?花药培养、花粉培养?胚珠或子房培养（未受精）胚珠或子房培养（未受精）2植物花药/花粉培养历史?Guha和Maheshwari（1964）曼陀罗花药培养?Nitsch 和 Norreel(1973)烟草花粉培养（游离小孢子培养）Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）?80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。?90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相继成功Konzak(1
2、999)。3花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养）花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）1.花药和花粉培养的概念：4?花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径发育途径”或或“雄核发育雄核发育”。?两者的异同点两者的异同点 培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没
3、有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。52.花药或花粉培养的意义：供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系2.1 作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。6例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。（2）提高了目标基因型的选择效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAa
4、bBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb7例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。（2）提高了目标基因型的选择效率单倍体二倍体AB-AABBaB-aaBBAb-AAbbab-aabb供体亲本AaBb花培8植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。（3）诱变育种中的作用92.2 物种进化研究可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染
5、色体组内是否存在同源染色体。2.3 遗传分析单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。2.4 构建连锁图谱双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建2.5 用于遗传转化能直接表达外源基因，不受显隐性影响。10单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。单倍体植物3个明显特点：1、体细胞染色体数减半2、生长发育弱，体形小3、雌雄配子严重不育113.花粉孢子体发育途径（雄核发育）123.1 花粉发育的阶段花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第一次有丝分裂或一次有丝分裂或之前。133.2 雄核发育途径1
6、1、A A途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（1）A-V途径由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2 2、B B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株14151、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启
7、动雄核发育。3.3 雄核发育启动机理161、胚状体发育途径小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。3.4 花粉植株形态发生方式17胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养18通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养19胚状体发育途径a)球形胚d)鱼雷形胚芸苔属小孢子培养20愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养21愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养224 花药和花粉培养方法234.1 花药培养1 1、
8、取材、取材镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2、消毒70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。3、培养固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。244.2 花粉培养(一一)花粉的分离与纯化花粉的分离与纯化1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械
9、游离（1）磁搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子25梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）26(二二)花粉培养方式花粉培养方式1、平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。4、看护培养利用花药
10、或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。27看护培养图解看护培养图解284.3 白化苗现象29（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因
11、素进行调控。30Case study:1、Canola(Brassica napus).Dihaploid plants were generated with high oleic and reduced linoleic and-linolenic acids in the seed oil and field tested for stability of the fatty acids and yield.3132Uninucleate microspores in suspension(Brassica napus)33Early stage embryos(7-10 days)(B
12、.napus)34Mid-stage Embryos(10-14 days)(B.napus)35Late stage embryos(21 days)(B.napus)36Late stage cotyledonary embryos(B.napus)37“Germination”Cotyledonary embryos transferred to lightgrowth conditions with GA3(B.napus)38Growth of haploid seedlings on solid culture medium(B.napus)39Well-developed hap
13、loid plantlet ready for transfer to soil,or for chromosome doubling(B.napus)40Mature dihaploid plants(B.napus)41Flow scheme for anther culture of banana2、banana42A Microspores isolated from banana anthers.Bar 14 m.B Development of callus from anthers after 5 months oninduction medium.Bar 2 mm.C Andr
14、ogenic embryos formed on calli.Bar 4 mm.D Haploid plantlets regenerated from anthers.Bar 3 cmAssani et al.Plant Cell Rep 2003,21,511 516435.影响雄核发育和花粉花药培养的因素（一）基因型植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。较大。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。44芸苔
15、属植物Brassica napusBrassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较Topas10,000-200,0001-20Westar1000-10,0000.1-1Delta100-10,0000.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型胚状体数量/106小孢子成苗率（%）45（二）供体植株生长条件和生理状态（二）供体植株生长条件和生理状态1、植株生长条件光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期一般是开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量46（
16、三）花粉发育时期（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导雄核小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。发育非常重要。47四分体:醋酸洋红染色四分体:Alexanders 染色单核期双核期成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子48单核晚期?液泡第一次有丝分裂后期双核早期双核中期?生殖核?生殖核营养核?49一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。?50不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期减数分裂期草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄单核早中期单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期单核
17、晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期单核早期至晚期烟草单核早期至双核期单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核四分孢子期至双核期期玉米51?对不同发育阶段的花药进行培养测试培养测试?确定最佳小孢子发育时期的形态特征?注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化处于不同发育阶段的烟草花芽花粉发育时期的确定52（四）预处理（四）预处理?预处理是小孢子培养成功的前提条件?预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加
18、。的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。?预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。高温、化学物质、离心、射线等。531、高低温处理低温预处理：指在接种之前将材料用0以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。例子:小麦穗子培养前4预处理几天，花药培养效率显著提高。十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。预处理方法：预处理方法：54高
19、温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。例子:如烟草，32高温；小麦，33高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996）552、化学物质处理?包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。3、其它?包括射线、离心、磁场等。56（五）培养基1.1.基本培养基基本培养基主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-培养基（适于马铃署）572.2.碳源碳源包括蔗
20、糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。583 3、激素4 4、氨基酸5 5、活性碳6 6、pH59（六）培养条件1 1、温度物种间有差异2、光照3 3、植板密度植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到2104ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。60（七）花药壁因素（七）花药壁因素花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤
21、会释放有毒物质影响小雄核的发育。616.单倍体植株鉴定和染色体加倍62一、倍性鉴定（为什么要进行倍性鉴定？）1、染色体直接计数法通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。63（4 4）杂交鉴定法）杂交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是
22、体细胞。（5 5）分子标记鉴定）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）64二、染色体加倍二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）（一）茎段培养（一）茎段培养将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。65二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）（二）化学试剂诱变有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素诱导（1）浸泡法无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理秋水仙素水溶液
23、直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。2、除草剂诱导（毒性小，引起植株的变异几率小）66花药和花粉培养基本流程：花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上胚状体转移至固化培养基上”萌发萌发”形成小植株。形成小植株。选择合适的供体植株倍性鉴定或染色体加倍67
