1、l目的与要求：目的与要求：l本章主要使学生了解微生物遗传因子的构成、本章主要使学生了解微生物遗传因子的构成、理解其中的概念、术语，掌握基因突变的特点、理解其中的概念、术语，掌握基因突变的特点、重要类型，诱变育种的操作过程，理解并掌握重要类型，诱变育种的操作过程，理解并掌握原核、真核生物基因重组和杂交育种的原理及原核、真核生物基因重组和杂交育种的原理及方法。方法。l重点、难点重点、难点l（1）基因突变的特点及重要类型）基因突变的特点及重要类型l（2）证明基因突变自发性和不对称性的的原理）证明基因突变自发性和不对称性的的原理l（3）诱变育种的原理、方法及操作过程）诱变育种的原理、方法及操作过程l（
2、4）基因重组及杂交育种的类型、原理基因重组及杂交育种的类型、原理遗传遗传：亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（遗传（inheritance）和变异（和变异（variation）是生命的最本质特性之一是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：表型表型：生物的全部遗传因子所携带的遗传信息生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境
3、有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型饰变：表型饰变：表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因变异、基因突变）遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为（自发突变频率通常为1010-6-6-10-10-9-9）Production of a red pigment(prodigiosin)by Serratia marcescens.Fro
4、m left to right:slant culture grown at 25C,slant culture grown at 37C,broth culture grown at 25C,broth culture grown at 37C.微生物是遗传学研究中的明星？微生物是遗传学研究中的明星？l一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验l（一）经典转化实验（一）经典转化实验（transformation）：）：F.Griffithl（二）噬菌体感染实验：（二）噬菌体感染实验：A.D.Hershey和和M.Chasel（三）植物病毒的重建实验：（三
5、）植物病毒的重建实验：H.Fraenkel-Conrat混合培养混合培养SIII型活菌型活菌SIII型热死菌型热死菌RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死病死病死病死（3）S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验热死热死SIII菌菌不生长不生长活活 RII 菌菌长出长出RII菌菌热死热死SIII菌菌长出大量长出大量RII菌和菌和10-6SIII菌菌活活R菌菌+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R菌菌和少量和少量S菌菌+活活RII菌菌平皿培养平皿培养1944年，年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子精确重复了转化实验
6、，确定了转化因子实验证明，将实验证明，将R菌转化为菌转化为S菌的转化因子是菌的转化因子是DNAlA.D.HersheyA.D.Hershey和和M.ChaseM.Chase，19521952年年（1）含）含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性l（2 2）含）含3535S-S-蛋白质的一组：放射性蛋白质
7、的一组：放射性75%75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验只有核酸（只有核酸（DNA、RNA）才是负载遗传）才是负载遗传信息的真正物质基础。信息的真正物质基础。二、二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式细胞水平：细胞水平：存在于细胞核或核区存在于细胞核或核区细胞核水平细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，原与真核生
8、物的细胞核结构不同，(核仁、固定形态、与组蛋白结合）核仁、固定形态、与组蛋白结合）核外核外DNA染色体水平染色体水平:不同生物染色体数不同生物染色体数p193染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数核酸水平核酸水平 ：DNA或或RNA，复合或裸露，双链或，复合或裸露，双链或单链单链l基因水平：基因水平：l基因：基因：l生物体内，一切具有自主复制能力的最小遗传功生物体内，一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，它的物质基础是一个具特定核苷酸顺序能单位，它的物质基础是一个具特定核苷酸顺序的核酸片段，的核酸片段，大小为大小为1000-1500bpl功能：表达和产生
9、基因产物功能：表达和产生基因产物l原核生物基因的表达通过组成操纵子形式：原核生物基因的表达通过组成操纵子形式：l命名命名原核生物的基因结构的特点：原核生物的基因结构的特点：1 1）染色体为双链环状的）染色体为双链环状的DNADNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；2 2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因组上遗传信息具有连续性；3 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4 4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rRNArRNA基因的多拷贝；基因的多拷贝；5 5）基因组的重复序列少而短；）基因组的重复序列少而短；真核微生物（啤酒酵母）的基因结构的特点：真核微
10、生物（啤酒酵母）的基因结构的特点：l 1 1）基因的非连续性）基因的非连续性 l 2 2）没有明显的操纵子结构）没有明显的操纵子结构 l 3 3）转录和转译有空间间隔）转录和转译有空间间隔l 4 4）重复序列多）重复序列多密码子水平：密码子水平：遗传密码：遗传密码：指指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。酸排列顺序。密码子：信息单位密码子：信息单位核苷酸水平：核苷酸水平：最低突变或交换单位，四种核苷酸最低突变或交换单位，四种核苷酸核外染色体核外染色体真核生物真核生物的的“质粒质粒”原核生物原核生物的质粒的质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体
11、（质体）（质体）卡巴颗粒卡巴颗粒酵母菌的酵母菌的2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒三、原核生物的质粒三、原核生物的质粒质粒（质粒（plasmid）：）：独立于核基因组外，能独立于核基因组外，能自主复制自主复制的小型共价闭合环状的小型共价闭合环状的双链的双链DNA分子分子（一（一 ）质粒的分子构型）质粒的分子构型通常以共价闭合环状通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称简称ccc)的超螺旋双链的超螺旋双链DNA分子存在于细胞质中；分子存在于细胞质中；也发现有线型双链也发现有线型双链DNA质粒和质粒和R
12、NA质粒质粒（二）（二）典型质粒典型质粒质粒所编质粒所编码的功能码的功能和赋予宿和赋予宿主的表型主的表型效应效应F质粒质粒（Fertility plasmid，F因子）因子）R质粒（质粒（Resistance plasmid，R因子）因子）Col质粒质粒（colicin plasmid）Ti质粒（质粒（tumor inducing plasmid）Ri质粒（质粒（root inducing plasmid)巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒P199-201细菌素细菌素抗生素抗生素抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌较广的抗菌谱通过核糖体直接合成的多肽类物质
13、通过核糖体直接合成的多肽类物质一般是次级代谢产物编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位于质粒或转座子上于质粒或转座子上一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在染色体上l(三三)质粒的主要生物学性质质粒的主要生物学性质l1 1、质粒的自我复制、质粒的自我复制 l2 2、质粒的存在形式：独立存在、附加体、质粒的存在形式：独立存在、附加体l3 3、质粒携带的基因、质粒携带的基因l4 4、质粒的亲和性和不亲和性、质粒的亲和性和不亲和性 l5 5、有的质粒具有转移性、有的质粒具有转移性 l6 6、拷贝数、拷贝数 严紧型质粒和松弛型质粒严紧型质粒和松弛型质粒l三、质粒在
14、基因工程中的应用质粒在基因工程中的应用 l质粒在基因工程操作中的优点质粒在基因工程操作中的优点 ：l1.1.体积小，便于体积小，便于DNADNA的分离和操作；的分离和操作；l2.2.呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；l3.3.有不受核基因组控制的独立复制起始点；有不受核基因组控制的独立复制起始点；l4.4.拷贝数多，使外源拷贝数多，使外源DNADNA可快速扩增；可快速扩增；l5.5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。克隆的检出和选择。E.ColiE.Coli 的的PBR322PBR322质粒质
15、粒第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种基因突变基因突变(gene mutation)(gene mutation)指细胞指细胞(或毒粒或毒粒)内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。传的变化。突变的原因：自发突变、诱变突变的原因：自发突变、诱变基因突变基因突变狭义：点突变狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变广义：基因突变和染色体畸变突变株（突变株（mutantmutant）：）：野生型（野生型（wild typewild type）：）：l一、基因突变的类型一、基因突变的类型l按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞按是否比较
16、容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：来分：l选择性突变株选择性突变株（selective mutantselective mutant）：）：l1.1.营养缺陷型营养缺陷型 （auxotrophauxotroph）l2.2.抗性突变型抗性突变型l3.3.条件致死突变型条件致死突变型l非选择性突变株非选择性突变株（non-selective mutantnon-selective mutant）：）：l4.4.形态突变型形态突变型l5.5.抗原突变型抗原突变型l6.6.产量突变型产量突变型l（二）突变率（二）突变率l定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突
17、变的几率。突变的几率。l突变率也可以用每一单位群体在每一世代中突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（产生突变株（mutantmutant，即突变型）的数目来，即突变型）的数目来表示。表示。l突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数l（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点l 1 1、自发性：、自发性：l 2 2、不对应性：、不对应性：l 3 3、稀有性：、稀有性：l 4 4、独立性：、独立性：l 5 5、可诱变性：、可诱变性：l 6 6、稳定性：、稳定性：l 7 7、可逆性：、可逆性：l（四）基因突变的自发性和不对应性的证明（四）基因突变的自发性和不对应
18、性的证明l1.1.变量试验变量试验fluctuation testfluctuation testl2.2.涂布试验涂布试验l3.3.平板影印培养试验（平板影印培养试验（replica platingreplica plating）变量试验又称波动试验或彷徨试验。变量试验又称波动试验或彷徨试验。19431943年，年，S.E.Luria S.E.Luria 和和M.Delbrck M.Delbrck 根据统计学原理，设计了左根据统计学原理，设计了左方的实验。方的实验。原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。l19521952年，年，J
19、.LederbergJ.Lederberg夫妇的论文夫妇的论文平板影印平板影印培养法和细菌突变株的间接选择培养法和细菌突变株的间接选择基因突变的具体类型基因突变的具体类型可归纳如下：可归纳如下：l诱发突变：诱发突变：l利用物理、化学、生物的因素，提高突变率的利用物理、化学、生物的因素，提高突变率的人为的作法人为的作法l诱变剂诱变剂（mutagenmutagen）：）：凡能提高突变率的任何凡能提高突变率的任何理化生物因子理化生物因子l定义定义：属于一种染色体的：属于一种染色体的微小损伤微小损伤（microlesionmicrolesion它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。它只涉及一对碱基被另一
20、对碱基所置换。l分类：分类：转换（转换（transitiontransition）l 颠换（颠换（transversiontransversionl定义：定义：一类可一类可直接直接与核酸的与核酸的碱基发生化学反应碱基发生化学反应的的诱变剂，不论在诱变剂，不论在机体内或是在离体条件机体内或是在离体条件下均有作下均有作用。用。l种类：种类：l亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，磺酸乙酯，N-N-甲基甲基-N-N硝基硝基-N-N-亚硝基胍亚硝基胍，N-N-甲甲基基-N-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等
21、）。等）。l作用：作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起从而引起DNADNA复制时碱基配对的转换，并进一步复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。使微生物发生变异。这类诱变剂主要是一些这类诱变剂主要是一些碱基类似物碱基类似物 ,如：如：5-5-溴尿溴尿嘧啶嘧啶(5-BU)(5-BU)和和5-5-氨基尿嘧啶（氨基尿嘧啶（55AUAU）、）、叠氮胸叠氮胸腺嘧啶（腺嘧啶（AITAIT）等）等；作用方式作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到通过活细胞的代谢活动参入到DNADNA分分子中，主要是在子中，主要是在DNADNA复制时碱基类似物插入复制
22、时碱基类似物插入DNADNA中，中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。引起碱基对配对错误，造成碱基置换。l指诱变剂使指诱变剂使DNADNA分子中增加（插入）或缺失分子中增加（插入）或缺失一个或一个或少数少数几个核苷酸，从而使几个核苷酸，从而使该基因该基因该部位后面的全部该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。l吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和-氨基吖啶等，以及一系列称为氨基吖啶等，以及一系列称为ICRICR类的化合物类的化合物l某些理化因子，还会引起某些理化因子，还会引起DNADNA的大损伤的大
23、损伤（macrolesionmacrolesion）染色体畸变，它包括：染色体畸变，它包括：染色体结构上的变化：染色体结构上的变化：缺失（缺失（deletiondeletion）重复（重复（duplicationduplication）易位（易位（translocationtranslocation）倒位（倒位（inversioninversion）染色体数目的变化染色体数目的变化转座转座 DNADNA序列通过非同源重组的方式，从染色体的某一部位转移到同一染色序列通过非同源重组的方式，从染色体的某一部位转移到同一染色体的不同部位或不同的染色体上某一部位的现象体的不同部位或不同的染色体上某一部位
24、的现象专座因子：专座因子：具有转座作用的这段具有转座作用的这段DNADNA序列，也称作序列，也称作跳跃基因（跳跃基因（jumping genejumping gene）或或可移动基因（可移动基因（movable genemovable gene）l转座因子的种类：转座因子的种类：l插入序列（插入序列（ISIS，insertion sequenceinsertion sequence）：）：l转座子（转座子（TnTn，transposontransposon）lMuMu噬菌体（即噬菌体（即 mutatormutator phage phage）l转座因子特点：转座因子特点：l非同源重组的方式转移
25、到染色体的新部位非同源重组的方式转移到染色体的新部位l两端各有一段末端重复序列两端各有一段末端重复序列l具有转座酶基因具有转座酶基因2、自发突变：无人为因素下的低频率突变自发突变：无人为因素下的低频率突变其原因：其原因：（1）背景辐射和环境因素引起）背景辐射和环境因素引起（2）有害产物积累）有害产物积累（3）碱基错配）碱基错配（六）紫外线对（六）紫外线对DNA的损伤及其修复的损伤及其修复嘧啶嘧啶嘧啶二聚体嘧啶二聚体UV1、光复活作用、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶二聚体嘧啶嘧啶光解酶光解酶2、切除修复切除修复（一）（一）自发突变与育种自发突变与育种1、从生产中育种、从生产中育种如：抗噬菌体感染，如：
26、抗噬菌体感染，“上酒白种上酒白种”2、定向培育优良菌株（、定向培育优良菌株（“驯化驯化”）如：炭疽活菌疫苗，卡介苗如：炭疽活菌疫苗，卡介苗（二）（二）诱变育种诱变育种诱变育种是指利用物理、化学等诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂诱变剂处理处理均匀而分散均匀而分散的微的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快简便、快速和高效的筛选速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。以供科学实验或生产实践使用。l1 1、诱变育种的基本原理和环节：诱变育种的基本
27、原理和环节：出发菌株出发菌株纯化、活化、同步培养纯化、活化、同步培养培养液培养液离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液单细胞或单孢子悬液活菌计数，诱变预备试验活菌计数，诱变预备试验诱变处理诱变处理活细胞计数，致死率计算活细胞计数，致死率计算中间培养中间培养(后培养后培养)平板分离平板分离 变异率计算变异率计算初筛初筛复筛复筛 保藏及扩大试验保藏及扩大试验1 1）选择简便有效的诱变剂）选择简便有效的诱变剂2 2）挑选优良的出发菌株（）挑选优良的出发菌株（original strainoriginal st
28、rain）3 3）处理单细胞或单孢子悬液处理单细胞或单孢子悬液4 4）选用最适的诱变剂量）选用最适的诱变剂量5 5）充分利用复合处理的协同效应（）充分利用复合处理的协同效应（synergismsynergism）6 6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标利用和创造形态、生理与产量间的相关指标7 7）设计高效筛选方案（筛选比诱变更重要）设计高效筛选方案（筛选比诱变更重要）8 8）创造新型筛选方法）创造新型筛选方法l诱变育种的主要环节：诱变育种的主要环节：l 诱变和筛选诱变和筛选l（1 1）诱变）诱变l紫外诱变方法紫外诱变方法:l设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等
29、l紫外灯：波长为紫外灯：波长为253.7nm,253.7nm,功率是功率是15W15Wl处理时的照射距离：处理时的照射距离：20cm 30cm20cm 30cml样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm 3mm 照射时，要用磁力搅拌器搅拌。照射时，要用磁力搅拌器搅拌。l处理剂量：用死亡率（处理剂量：用死亡率（70%75%70%75%）表示照射剂）表示照射剂量量l化学诱变剂：化学诱变剂：NTGNTGl检测化学诱变剂的操作检测化学诱变剂的操作lAmesAmes试验：试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境和食
30、品中是否存在化学致癌剂的简便有来检测环境和食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。效方法。l原理：原理：l原因：原因：l 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比，超过正比，超过95%95%的致癌物质对微生物有诱变作用，的致癌物质对微生物有诱变作用，90%90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用lAmesAmes试验的操作：试验的操作：l（2 2）菌种筛选）菌种筛选l1 1、初筛和复筛两步进行、初筛和复筛两步进行l初筛的目的：以量为主（选留有生产潜力的菌株）初筛的目的：以量为主（选留有生产潜力的菌株）l复筛的
31、目的：复筛以质为主，应精确测定生产潜力复筛的目的：复筛以质为主，应精确测定生产潜力较大的每个菌株的生产指标，确认符合要求的菌株较大的每个菌株的生产指标，确认符合要求的菌株l2、以选育高产突变株为例，诱变育种的筛选过程、以选育高产突变株为例，诱变育种的筛选过程如下：如下：第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200200个菌株个菌株选出选出5050株株选出选出5 5株株诱变处理初筛初筛（每瓶一株）（每瓶一株）复筛复筛（每瓶四株）（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株 选出选出50株株 选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理诱变处理初筛初筛复筛复筛（每
32、瓶一株）（每瓶一株）（每瓶四株）（每瓶四株）诱变处理诱变处理l3 3、变异菌的一般筛选方法、变异菌的一般筛选方法l平皿快速检测法平皿快速检测法变色圈法变色圈法透明圈法透明圈法生长圈法生长圈法抑菌圈法抑菌圈法梯度平板法梯度平板法l摇瓶培养法摇瓶培养法l4 4、特殊变异菌的筛选方法：、特殊变异菌的筛选方法：l（1 1）产量突变株的筛选）产量突变株的筛选l 琼脂块培养法琼脂块培养法l（2 2）抗药性突变株的筛选）抗药性突变株的筛选l 梯度平板法梯度平板法l（3 3）营养缺陷型突变株的筛选）营养缺陷型突变株的筛选l l la.a.与与营养缺陷型突变有关的概念：营养缺陷型突变有关的概念：l野生型：野生型
33、：l营养缺陷型：营养缺陷型：l原养型：原养型：l基本培养基：基本培养基：l完全培养基完全培养基:l补充培养基补充培养基;营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法l第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种l基因重组（基因重组（gene recombinationgene recombination）：l两个独立基因组内的遗
34、传基因转移到一起，经过两个独立基因组内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成稳定的新遗传型的遗传分子间的重新组合，形成稳定的新遗传型的过程过程l重组与杂交的关系：重组与杂交的关系：l基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。l一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组l基因重组的方式：基因重组的方式：l 转化转化l 转导转导l 接合接合l 原生质体融合原生质体融合l（一）转化（一）转化（transformationtransformation）l1 1、转化及其发现：、转化及其发现：l定义：定义：感受态感受态受体菌受体菌直接摄取直接摄取来自供体菌的来自供体
35、菌的游离游离DNADNA片段片段，经重组而获得后者部分遗传性状的，经重组而获得后者部分遗传性状的现现象象，称为转化。，称为转化。l转化后的的受体菌称为转化子（转化后的的受体菌称为转化子（transformanttransformant）。）。l发现：发现：lR R型活菌型活菌+S+S型死菌型死菌 S S型活菌型活菌l2 2、转化发生的条件、转化发生的条件l受体细胞要处于受体细胞要处于感受态（感受态（competencecompetence）.l外源游离外源游离DNADNA分子（转化因子）分子（转化因子）l菌株间的亲缘关系密切菌株间的亲缘关系密切l 3 3、感受态细胞形成的方式：、感受态细胞形成
36、的方式：l自然感受态自然感受态l人工感受态人工感受态l感受态因子：感受态因子：l调节感受态的一类特异蛋白质，主要包括膜相关调节感受态的一类特异蛋白质，主要包括膜相关DNADNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。l4 4、转化的过程、转化的过程l以以S.S.PneumoniaPneumoniae e strstr（肺炎链球菌抗链霉素菌（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：株）为例，大致可分为六阶段：l吸附：吸附：l切割：切割：l入胞：入胞：l重组：重组：l复制：复制：l转化子形成：转化子形成：strrl5 5、转染（、转染（transfectio
37、ntransfection）l定义：定义：l 把噬菌体或其它病毒的把噬菌体或其它病毒的DNADNA（或（或RNARNA）抽提出抽提出来来，让它去感染感受态的宿主细胞或原生质体，让它去感染感受态的宿主细胞或原生质体，并进而产生并进而产生正常的噬菌体正常的噬菌体或病毒的后代，这种现或病毒的后代，这种现象称为转染（象称为转染（transfectiontransfection）。）。l与转化的区别：与转化的区别：l病毒或噬菌体核酸并非作为供体基因的功能病毒或噬菌体核酸并非作为供体基因的功能l中间不发生任何遗传因子的交换或整合中间不发生任何遗传因子的交换或整合l最后不产生转化子最后不产生转化子l（二）细
38、菌的转导（二）细菌的转导（transductiontransduction）l1.1.转导及其发现转导及其发现l转导：由缺陷噬菌体介导的，把供体细胞的小片段转导：由缺陷噬菌体介导的，把供体细胞的小片段DNADNA携带进受体细胞中进行遗传交换与整合使受体携带进受体细胞中进行遗传交换与整合使受体细胞获得前者部分遗传形状的现象细胞获得前者部分遗传形状的现象lJ.LederbergJ.Lederberg等（等（19521952）在）在Salmonella Salmonella typhimuriumtyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。AB-Try+his+Tr
39、y-his+Try+his-l2.2.转导的种类转导的种类l转导转导普遍转导普遍转导局限转导局限转导完全普遍转导完全普遍转导流产普遍转导流产普遍转导低频转导低频转导高频转导高频转导l（1 1）普遍性转导普遍性转导（generalized transductiongeneralized transduction）l定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNADNA小片段的小片段的“误包误包”而实现其遗传性状传递至受体菌而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象的转导现象l媒介：温和噬菌体（媒介：温和噬菌体（P22P22噬菌体）噬菌体）l分类：分类：l完全
40、普遍转导完全普遍转导l流产普遍转导流产普遍转导l完全普遍转导的过程完全普遍转导的过程l进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子换而形成稳定的转导子l流产普遍性转导（流产普遍性转导（abortive transductionabortive transduction）l概念：概念：l 受体菌经转导获得的供体受体菌经转导获得的供体DNADNA片段在受体菌片段在受体菌中不发生配对交换和整合中不发生配对交换和整合、复制、复制，也不迅速消失，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称
41、为就称为流产普遍转导。流产普遍转导。l现象：现象：l 进行细胞分裂时，只能将这段外源进行细胞分裂时，只能将这段外源DNADNA分配分配给一个子细胞。给一个子细胞。流产普遍性转导的过程流产普遍性转导的过程l（2 2）局限性转导局限性转导l定义：定义：l 通过通过部分缺陷部分缺陷的的温和噬菌体温和噬菌体把供体菌的把供体菌的少数特少数特定基因定基因携带到受体菌中，并与后者基因组整合、重携带到受体菌中，并与后者基因组整合、重组形成转导子的现象。组形成转导子的现象。l分类：低频转导与高频转导分类：低频转导与高频转导l低频转导低频转导l高频转导高频转导l双重溶源菌双重溶源菌温和噬菌体温和噬菌体裂解时的裂解
42、时的不正常切割：不正常切割：包含包含galgal或或biobio基因基因缺陷噬菌体缺陷噬菌体DNADNA分子在宿主细胞内能够象正常的分子在宿主细胞内能够象正常的DNADNA分子一样进行复制、包装，提供所需分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，感染受体细胞后，通过，通过DNADNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。低频转导低频转导低频转导低频转导裂解物裂解物正常噬菌体正常噬菌体极少量的极少量的部分部分缺陷噬菌体缺陷噬
43、菌体（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）转导颗粒转导颗粒局限转导子局限转导子（极少量）（极少量）低感染复数低感染复数高频转导高频转导低频转导低频转导裂解物裂解物正常噬菌体正常噬菌体极少量的极少量的部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）转导颗粒转导颗粒高感染复数高感染复数双重溶源菌双重溶源菌缺陷噬菌缺陷噬菌体和正常体和正常噬菌体同噬菌体同步复制步复制高频转导高频转导裂解物裂解物部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）正常噬菌体正常噬菌体等等量量转导转导颗粒颗粒局限转导子局限转导子（大量）（大量）低感染低感染复数复数E.coli K12()gal+
44、(供体菌供体菌)(大量大量)+dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌受体菌)E.coliK12Sgal-/dgal+E.coliK12Sgal-/dgal+/E.coliK12Sgal-/dgal+/（双重溶源菌供体）双重溶源菌供体）(50%)+dgal+（50%）E.coliK12Sgal-(受体菌受体菌)E.coliK12Sgal-/dgal+（转导子）转导子）（双重容源（双重容源转导子）转导子）低频转导低频转导高频转导高频转导U.V.U.V.相同点：均以噬菌体为媒介，导致遗传物质的转移。相同点：均以噬菌体为媒介，导致遗传物质的转移。不同点：不同点：普普 通通 性性 转
45、转 导导 局局 限限 性性 转转 导导1 1）能够转导的基因：）能够转导的基因：供体菌的几乎任何基因供体菌的几乎任何基因 供体菌的少数基因。供体菌的少数基因。2 2）噬菌体的位置：）噬菌体的位置：不整合到寄主染色体上。不整合到寄主染色体上。整合到寄主染色体上。整合到寄主染色体上。3 3）转导噬菌体的获得：可通过裂解反应得到。）转导噬菌体的获得：可通过裂解反应得到。只能通过诱导溶源菌得到。只能通过诱导溶源菌得到。4 4）转导子的性质：）转导子的性质：属非溶源型，转导的属非溶源型，转导的 属缺陷溶源型，转导属缺陷溶源型，转导 物质主要是供体菌的物质主要是供体菌的 的物质有供体的的物质有供体的DNA
46、DNA DNADNA。和噬菌体和噬菌体DNADNA。l（3 3）溶源转变）溶源转变l概念：概念：l 当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。溶源转变。l与转导的不同：与转导的不同：l不携带外源基因不携带外源基因l噬菌体是完整的，而不是缺陷的；噬菌体是完整的，而不是缺陷的；l没有经过遗传重组，不形成转导子没有经过遗传重组，不形成转导子l新性状随噬菌体的消失而丧失新性状随噬菌体的消失
47、而丧失l（三）接合（三）接合（conjugationconjugation）l概念：概念：l 供体菌（供体菌（“雄雄”）通过其性菌毛与受体菌）通过其性菌毛与受体菌（“雌雌”）相接触，把）相接触，把F F质粒或其携带的不同长质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给受体细胞，使后者获得度的核基因组片段传递给受体细胞，使后者获得新遗传性状的现象。新遗传性状的现象。l1 1、结合现象的发现、结合现象的发现l19461946年年Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm用用E.coliE.coli的两个多重营养缺陷型所作的实验：的两个多重营养缺陷型所作的实验：Met+bio+
48、thr+leu+Met-bio-thr+leu+Met+bio+thr-leu-Met.bio.thr.leu-+混合培养混合培养离心洗涤后离心洗涤后l证实接合过程需要细胞间的直接接触的证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”U”型管实验型管实验（Bernard DavisBernard Davis，1950 1950）2、接合机制、接合机制(大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制)lE.coli的的F因子：决定性别的质粒，属于附加体因子：决定性别的质粒，属于附加体（episome）l3 3、F F因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式lF F+菌株菌株lF F-菌株菌株lHfrHfr菌株菌株lF
49、F菌株菌株l4 4、接合转移过程、接合转移过程l（1 1）F+F+F-F-杂交杂交l2）Hfr F-杂交杂交中断杂交中断杂交（interrupted mating）技术技术（3 3）FFF-F-杂交杂交F因子转导因子转导 F-mediated transduction:“接合接合”“转导转导”及及“转化转化”这三种在自然界中存在的细菌这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：遗传重组过程各自的特点：l（四）原生质体融合（四）原生质体融合protoplast fusionprotoplast fusionl概念：概念：l通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质通过人为方法，使遗传性状
50、不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。融合。l由此法获得的重组子称为融合子。由此法获得的重组子称为融合子。l原生质体融合的主要步骤：原生质体融合的主要步骤：l选择亲株选择亲株 制备原生质体制备原生质体原生质体融合原生质体融合 原生质体原生质体 再生再生 筛选优良性状的融筛选优良性状的融合重组子合重组子l二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组l主要方式：主要方式：l有性杂交有性杂交l准性杂交准性杂交l原生质体融合（略）原生质
