1、 DNA的合成及重组的合成及重组 DNA Biosynthesis and Recombination第十六章第十六章DNA生物合成生物合成DNA复制复制（DNA指导的指导的DNA合成合成）逆转录逆转录 (逆转录病毒逆转录病毒RNA指导的指导的DNA合成合成)校正复制中可能出现的错误，并修复受到损校正复制中可能出现的错误，并修复受到损伤的伤的DNA细胞中酶促修复系统细胞中酶促修复系统自然界自然界DNADNA重组和基因转移的基本方式重组和基因转移的基本方式基因组复制的主要特点基因组复制的主要特点The General features of Genome Replication 第一节第一节复制
2、起点（复制起点（origin）：指：指DNA复制所必需的一段复制所必需的一段特殊的特殊的DNA序列。序列。双螺旋双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构复制时，复制区生长点的结构呈呈Y形或叉形，称之为形或叉形，称之为复制叉。复制叉。（二）复制过程中形成复制泡和复制叉（二）复制过程中形成复制泡和复制叉目目 录录从一个从一个DNA复制起点起始的复制起点起始的DNA复制区域，复制区域，它是一个独立复制单位，包括复制起点和终点。它是一个独立复制单位，包括复制起点和终点。复制子（复制子（replicon）（三）复制的基本单位称为复制子（三）复制的基本单位称为复制子 （四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传
3、（四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递递（1）全保留式（全保留式（conservative），即恢复原来的，即恢复原来的DNA双螺旋，并产生一个新的子代双螺旋，并产生一个新的子代DNA双双螺旋；螺旋；（2）半保留式（半保留式（semiconservative），即新老搭，即新老搭配，由一条新合成的配，由一条新合成的DNA链和一条复制模链和一条复制模板链配对产生子代双螺旋板链配对产生子代双螺旋DNA；（3）散布式（散布式（dispersive），），即复制模板链被分即复制模板链被分成许多小片段，散布于子代成许多小片段，散布于子代DNA中。中。两条新合成的两条新合成的DNADNA链和两条原来的
4、复制模板链和两条原来的复制模板链之间的结合方式可能性：链之间的结合方式可能性：密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制方式方式含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果前导链（前导链（leading strand）:DNA复制时，一条链复制时，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合成的新链。成的新链。后随链（后随链（lagging strand）:另一条链的合成方向另一条链的合成方向与复制叉前
5、进方向相反，不能连续复制，只能分成若与复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链中的小片段称为中的小片段称为冈崎片段（冈崎片段（Okazaki fragments)。（五）半不连续复制克服了（五）半不连续复制克服了DNA空间结构空间结构 对对DNA新链合成的制约新链合成的制约前导链连续复制而后随链不连续复制，即前导链连续复制而后随链不连续复制，即DNA半半不连续不连续复制复制。复制起点的一般特征复制起点的一般特征:由多个独特的短重复序列组成。由多个独特的短重复序列组成。短重复序列被多亚基的复制起始因子
6、所识别并结合。短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。一般富含一般富含AT，利于双螺旋，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链解旋，以产生单链DNA复制模板。复制模板。E.coli 复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 同向重复序列同向重复序列 反向重复序列反
7、向重复序列5 3 5 3 酵母复制起点为酵母复制起点为自主复制序列（自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：酵母染色体含有多个复制起点。酵母染色体含有多个复制起点。元件元件A(富含富含A/T的共有序列的共有序列)：结合一个特异的蛋白质：结合一个特异的蛋白质复合物复合物复制起点识别复合物复制起点识别复合物(ORC)。3个序列个序列(B1、B2和和B3)可以增加复制起点的效率，其可以增加复制起点的效率，其中中B2的的9个碱基与上述个碱基与上述ARS共有序列相同。共有序列相同。酵母复制起始点酵母复制起始点DNA聚合酶不能从聚合酶不能从游离的核苷酸
8、游离的核苷酸开始合成开始合成DNA链，必须由引物（链，必须由引物（primer）提供自由的）提供自由的3-OH末端末端，通过加入核苷酸使之不断延伸。，通过加入核苷酸使之不断延伸。所有细胞和多数病毒的所有细胞和多数病毒的DNA复制，首先利用复制，首先利用模板合成一段模板合成一段RNA引物引物，这一过程为，这一过程为引发引发（priming）。RNA引物引物5 端的第一个核苷酸通常是端的第一个核苷酸通常是pppA（个别为（个别为pppG）。）。1.1.多数多数DNA复制使用复制使用RNA引物引物174等噬菌体等噬菌体以双链以双链环形环形DNA的一条链上产的一条链上产生切口处的生切口处的3-OH为引
9、物；为引物；腺病毒及某些线性腺病毒及某些线性DNA病毒病毒以结合于病毒以结合于病毒DNA的的5 端磷酸基团的末端蛋白上的端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的的3-OH为引物开始复制。为引物开始复制。2.个别个别DNA复制以复制以DNA或核苷酸为引物或核苷酸为引物 DNA复制过程复制过程 Process of DNA Replication第二节第二节DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶，即拓扑异构酶）、）、单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand binding protein,SSB)DNA复制需要复制需要6种蛋白因子：种蛋白因子：E
10、.coli DNA复制起始复制起始 结合结合oriC的的4个个9bp反向重复序列形成反向重复序列形成复制起复制起始复合物始复合物。作用于作用于oriC的的3个个13bp正向重复序列，正向重复序列，DNA在在这这3个位点解链，形成个位点解链，形成开放型复合物（开放型复合物（open complex）。DnaA蛋白蛋白53 解旋酶作用产生两条复制模板链解旋酶作用产生两条复制模板链激活引发酶激活引发酶DnaG蛋白蛋白DnaB蛋白与引发酶结合，形成引发体蛋白与引发酶结合，形成引发体DnaB蛋白蛋白使一条使一条DNA链围绕着另一条旋转，消除解链围绕着另一条旋转，消除解旋产生的张力。旋产生的张力。促旋酶促
11、旋酶SSBSSB蛋白蛋白HUHU蛋白蛋白稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA构象，有助于解旋。构象，有助于解旋。DNA结合蛋白，对复制起促进作用。结合蛋白，对复制起促进作用。HU蛋白能够使蛋白能够使DNA发生折叠。发生折叠。E.coli 中中DnaB结合引发酶结合引发酶DnaG，催化合成，催化合成RNA引物，其序列始于引物，其序列始于pppAG，模板链序列，模板链序列3-GTC-5，引物长度一般，引物长度一般1112个碱基。个碱基。（二）引发酶合成（二）引发酶合成RNA引物引物负责切除负责切除RNA引物。引物。（三）复制时聚合酶（三）复制时聚合酶催化催化DNA合成而合成而 聚合酶聚合酶切除引
12、物切除引物DNA聚合酶聚合酶可利用损伤尚未修复的可利用损伤尚未修复的DNA链链作为模板合成作为模板合成DNA，但不能修，但不能修复损伤。复损伤。负责合成负责合成DNA。DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶TLS1 Rev 1TLS，体细胞高变，体细胞高变1Pol 相对准确的相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体）（穿越环丁烷二聚体）1Pol TLS1Pol 体细胞高变（体细胞高变（somatic hypermutation）1Pol 减数分裂相关的减数分裂相关的DNA损伤修复损伤修复1Pol TLS1Pol DNA交联损伤修复交联损伤修复1Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷
13、酸切除修复，碱基切除修复4Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复23Pol 线粒体线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复3Pol 碱基切除修复碱基切除修复1Pol 合成引物合成引物4Pol 功能功能亚基数目亚基数目真核生物真核生物TLS（translesion synthesis）3Pol (UmuC,UmuD)DNA损伤修复，穿越损伤合成（损伤修复，穿越损伤合成（TLS）1Pol (Din B)染色体染色体DNA复制复制9Pol 全酶全酶染色体染色体DNA复制复制3Pol 核心酶核心酶DNA损伤修复损伤修复1Pol 去除去除RNA引物，引物，DN
14、A损伤修复损伤修复1Pol 功能功能亚基数目亚基数目原核生物（原核生物（E.coli）原核、真核细胞原核、真核细胞DNADNA聚合酶的类型和功能聚合酶的类型和功能目目 录录个核心酶个核心酶1个个-复合物（复合物（、6种亚种亚基）基）可滑动的可滑动的DNA夹子夹子（含（含1对对-亚基）亚基）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构包括：全酶结构包括：亚基亚基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亚基亚基具有具有35 外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用核心酶由核心酶由、和和 亚基组成：亚基组成：2个
15、个-亚基亚基分别和分别和1个核心酶相互作用，其个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。前导链和后随链。功能：功能：-复合物是复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将夹子加载蛋白，负责将可沿可沿DNA链滑动的一对链滑动的一对-亚基（亚基（DNA夹夹子）加载于子）加载于DNA，使，使DNA聚合酶聚合酶具有具有持续合成能力。持续合成能力。-复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成：、在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链3 5 3 5
16、 3 5 3 5 前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)解链方向解链方向冈崎片段冈崎片段3 5 53 外切酶：外切酶：去除去除RNA引物引物35 外切酶：外切酶：起校正作用起校正作用DNA聚合酶活性：聚合酶活性：填补两个冈崎片段之间的缺口填补两个冈崎片段之间的缺口DNA聚合酶聚合酶有有3个酶促活性结构域个酶促活性结构域:323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段：大片段：Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋
17、白酶DNA-pol Tus蛋白具有蛋白具有反解旋酶（反解旋酶（contra-helicase）活性活性，识别并结合识别并结合ter序列中共有序列，阻止序列中共有序列，阻止Dna B蛋白的解旋作用，从而蛋白的解旋作用，从而抑制复制叉前进抑制复制叉前进。Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造成能造成复制体解体复制体解体。(四四)Tus蛋白识别复制终点使复制终止蛋白识别复制终点使复制终止在复制叉汇合点两侧约在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个处各有一个终止区（终止区（ter D/A和和ter C/B）。）。当当oriC处于处于半甲基化状态半甲基化状态时，时
18、，SeqA蛋白迅速结合蛋白迅速结合半甲基化的半甲基化的GATC，阻止，阻止Dam甲基化酶与之结合，甲基化酶与之结合，使复制起点不能被完全甲基化，同时使复制起点不能被完全甲基化，同时阻止阻止DnaA蛋蛋白结合白结合oriC。oriC的的GATC被完全甲基化被完全甲基化，DnaA蛋白就能与之蛋白就能与之结合结合，开始新的一轮复制，开始新的一轮复制。(五五)DNA甲基化保证复制起点在每个复制周甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用期中仅起一次作用E.coli复制起点复制起点oriC含有含有11个拷贝个拷贝GATC，这一回，这一回文序列中的文序列中的A是是Dam甲基化酶的靶位点甲基化酶的靶位点
19、。在复制过程中，在复制过程中，DNA每复制每复制10bp，复制叉前方的，复制叉前方的模板模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正正超螺旋超螺旋。拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结合合DNA分子上的磷酸基团，分子上的磷酸基团，切断磷酸二酯键切断磷酸二酯键。(六六)DNA复制需要两类复制需要两类DNA拓扑异构酶拓扑异构酶消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。维持维持E.coli、噬菌体和质粒、噬菌体和质粒DNA复制起始模板复制起始模板DNA负超螺旋状态。负超螺旋状态。环形染色体复
20、制后产生的两个子染色体连环体环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体解连环。解连环。DNA拓扑异构酶功能：拓扑异构酶功能：E.coIi的的Topo只作只作用于负超螺旋用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋。消除负超螺旋。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的功能：的功能：E.coli的的Topo将将前方产生的正超前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋转变为负超螺旋。螺旋。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的功能的功能E.coli 的的Topo功能功能是将复制产生的两个是将复制产生的两个子染色体从连环体中子染色体从连环体中分离出来，催化连环分离出来，催化连环和去连环过程和去连环过程。真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生
21、物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚聚合酶合酶/转换；转换；切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。二、真核生物二、真核生物DNA复制和原核生物相复制和原核生物相似但更为复杂似但更为复杂真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异：(一一)常见的真核细胞常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种A家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol同源，包括同源，包括Pol 和和Pol B家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol 同源，包括同源，包括Pol 、
22、和和C家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol 同源，仅在真菌中发现同源，仅在真菌中发现X家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性，却与末聚合酶并无同源性，却与末端转移酶同源，成员包括端转移酶同源，成员包括Pol 、Y家族家族（UmuC/DinB超家族），近年发现一个特殊超家族），近年发现一个特殊的真核及原核的真核及原核DNA聚合酶家族，成员包括聚合酶家族，成员包括Pol 、和和Rev1Pol 负责合成引物负责合成引物Pol 负责负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复修复Pol 的功能与的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定）相似（其确切功能尚待定）Po
23、l 可能和碱基切除修复有关可能和碱基切除修复有关Pol 负责线粒体负责线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复常见的真核常见的真核DNA聚合酶有聚合酶有5种：种：拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋超螺旋Tol和和TolDNA双螺旋解链，参与组装引发体双螺旋解链，参与组装引发体DNA解旋酶解旋酶连接冈崎片段连接冈崎片段DNA连接酶连接酶核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物RNAse H核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修
24、复，碱基切除修复Pol /合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引发酶引发酶有依赖有依赖DNA的的ATPase活性，结合于引物活性，结合于引物-模板链，激活模板链，激活DNA聚合酶，聚合酶，促使促使PCNA结合于引物结合于引物-模板链模板链RFC激活激活DNA聚合酶和聚合酶和RFC的的ATPase活性活性PCNA单链单链DNA结合蛋白，激活结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合聚合酶，使解旋酶容易结合DNARPA功功 能能蛋白质蛋白质真核真核DNA复制叉主要蛋白质的功能复制叉主要蛋白质的功能(二二)真核真核DNADNA复制叉主要蛋白质的类型和功能复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相
25、似与原核基本相似DNA聚合酶聚合酶（Pol ）分子含有）分子含有4个亚基：个亚基：1.DNA聚合酶聚合酶/引发酶复合物合成引发酶复合物合成RNA-DNA引物引物 p180：催化亚基：催化亚基 p48：具有引发酶活性：具有引发酶活性 p58：p48的稳定性和活性所必需的的稳定性和活性所必需的 p70：与组装引发体有关：与组装引发体有关功能：功能：合成合成RNA引物引物反应过程反应过程：调节：调节：磷酸化的调节作用磷酸化的调节作用Pol /引发酶复合物引发酶复合物首先，合成首先，合成RNA引物；引物；其次，利用其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（in
26、itiator DNA，iDNA）短序列，形成）短序列，形成RNA-DNA引物；引物；最后，最后，Pol /引发酶脱离模板链引发酶脱离模板链DNA，发生，发生DNA聚合聚合酶转换（酶转换（switch）。）。结构：结构：p70、p34和和p11组成异源三聚体组成异源三聚体功能：功能：2.RPA的功能与的功能与E.coli的的SSB相似相似复制蛋白复制蛋白A（replication protein A，RPA）结合单链结合单链DNA促使双螺旋促使双螺旋DNA解旋解旋激活激活Pol /引发酶活性引发酶活性为为Pol 依赖复制因子依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原）和增殖细胞核抗原（PCNA）
27、合成）合成DNA所必需所必需RPA三聚体与三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需抗原结合，组装引发体复合物所必需RPA参与参与DNA重组和修复重组和修复p140 结合结合PCNAp40、p37和和p36组成稳定的核心复合物，具有组成稳定的核心复合物，具有依赖依赖DNA的的ATPase活性活性p38可能在可能在p140和核心复合物之间起连接作用和核心复合物之间起连接作用3.RFC与与E.coli DNA聚合酶聚合酶的的-复合物功能相似复合物功能相似复制因子复制因子C（replication factor C，RFC）结构：结构：有有p140，p40，p38，p37、p36 5个亚基
28、个亚基促使可滑动的促使可滑动的DNA夹子夹子PCNA结合于引物结合于引物-模板链，是模板链，是Pol 在模板在模板DNA链上组装并形成具链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。有持续合成能力全酶所必需的。RFC的功能：的功能：PCNA是是Pol 的进行性因子，使的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNA是协调是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。调控的核心因子。PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。水平是检测细胞增殖的重要指标。PCNA能激活能激活Pol 。4.PCNA是可滑动的是可滑动的DNA夹子夹子增殖
29、细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）结构：结构：功能：功能：同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动DNADNA夹子。夹子。p125：催化亚基，具有：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35 核酸外核酸外切酶活性，其切酶活性，其N端区与端区与PCNA相互作用相互作用p50：辅助：辅助PCNA激活激活p1255.DNA聚合酶聚合酶 合成前导链和后随链合成前导链和后随链结构：结构：Pol 分子是异源二聚体（分子是异源二聚体（p125和和p50）功能：功能：Pol 合成前导链和后随链合成前导链和
30、后随链DNA聚合酶聚合酶 FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内切酶和）具有核酸内切酶和53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。FEN1参与去除冈崎片段参与去除冈崎片段5 端的端的RNA引物。引物。6.FEN1和和RNAse H切除切除RNA引物引物RNAse H是是核酸内切酶核酸内切酶，参与冈崎片段成，参与冈崎片段成熟时熟时切除切除5 端端RNA引物引物，底物，底物RNA连接在连接在DNA链链的的5 端，切割后在端，切割后在DNA链的链的5 端残留一个核糖核端残留一个核糖核苷酸，这个核苷酸再被苷酸，这个核苷酸再被FEN1切除。切除。DNA复制需要复制需要DNA解旋酶打开解
31、旋酶打开DNA双螺双螺旋，使复制模板链得以暴露旋，使复制模板链得以暴露。7.DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板8.真核复制叉有真核复制叉有1个个Pol 和和2个个Pol 复合物复合物真核真核DNA复制叉模型复制叉模型Pol /引发酶引发酶合成合成RNA-DNA引物引物Pol 合成前导链和后随链合成前导链和后随链RFC 识别引物识别引物iDNA的的3 端并驱除端并驱除Pol /引发酶引发酶PCNA 结合结合DNA并引入并引入Pol RNAse H I/FEN1 切除冈崎片段切除冈崎片段5 端的端的RNA引物引物真核生物复制过程中酶及功能真核生物复制过程中酶及功能P
32、ol （或（或Pol ）填补冈崎片段之间的空隙填补冈崎片段之间的空隙DNA连接酶连接酶 封口封口RPA 稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA解旋酶解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力释放复制叉前进时产生的扭曲应力(三三)引发和延伸发生引发和延伸发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换 识别染色体识别染色体DNA复制起点和复制起点和DNA局部解旋后，局部解旋后，Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做叫做引发体组装引发体组装。引发体组装引发体组装包括包括DNA解旋酶解旋酶与与Pol /
33、引发酶引发酶相相互作用。互作用。1.解旋酶与解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体引发酶相互作用组装引发体 前导链：出现在引发后期前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生发生DNA聚合酶聚合酶/转换的原因是转换的原因是Pol 不具备不具备持续合成能力持续合成能力 DNA聚合酶聚合酶/转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC2.DNA聚合酶聚合酶/转换转换真核真核DNA聚聚合酶转换和合酶转换和后随链合成后随链合成首先首先RNAse H利用核酸内切酶活性切割连接在冈利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段崎片段5 端的端的RNA片段，在片段，
34、在RNA-DNA引物连接点旁留下引物连接点旁留下1个核糖核苷酸；个核糖核苷酸；然后然后FEN1利用利用53 核酸外切酶活性切除这最后一核酸外切酶活性切除这最后一个核糖核苷酸。个核糖核苷酸。(四四)切除切除RNA引物有两种机制引物有两种机制解旋酶解旋酶Dna2具有依赖具有依赖DNA的的ATPase和和35 解旋酶解旋酶活性，其解旋作用可以使前一个冈崎片段的活性，其解旋作用可以使前一个冈崎片段的5 端引物形成端引物形成“盖子盖子”结构，再由结构，再由FEN1的内切酶活性切除引物。的内切酶活性切除引物。依赖依赖RNAse H/FEN1切除方式：切除方式：依赖依赖Dna2/FEN1切除方式：切除方式：
35、切除切除RNA引物的两种机制引物的两种机制RNAse H/FEN1Dna2/FEN1真核所有染色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞复制仅仅出现在细胞周期的周期的S期期，而且只能复制一次。，而且只能复制一次。(五五)真核染色体在每个细胞周期中只能复制真核染色体在每个细胞周期中只能复制一次一次1.前复制复合物在前复制复合物在G1期形成而在期形成而在S期被激活期被激活真核细胞真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制的起始分两步进行，即复复制基因的选择制基因的选择和和复制起点的激活。复制起点的激活。复制基因（复制基因（replicator）是指是指DNA复制起始复制起始所所必需的必需的全部全部
36、DNA序列序列。复制基因的选择复制基因的选择出现于出现于G1期期，基因组的每个复，基因组的每个复制基因位点均组装制基因位点均组装前复制复合物（前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。复制起点的激活复制起点的激活出现于细胞进入出现于细胞进入S期期以后，这一以后，这一阶段将阶段将激活激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋，募集若干复制基因结合蛋白和白和DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。在原核细胞中，复制基因的识别与在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解解旋、募集旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个
37、阶段相分离可以确保每个染色体在中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。每个细胞周期中仅复制一次。ORC至少募集两种解旋酶加载至少募集两种解旋酶加载蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。复制起点识别复合物（复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因。识别并结合复制基因。三种蛋白质一起募集真核细胞三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶解旋酶Mcm2-7。前复制复合物（前复制复合物（pre-RC）的形成）的形成pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子并起始复制，复制因子包括并起始复制，复制
38、因子包括3种种DNA聚合酶。聚合酶。DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和和Pol 结合，然后是结合，然后是Pol /引发酶。引发酶。在在S期期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷）磷酸化，从而被激活。酸化，从而被激活。pre-RC的激活的激活和组装真核和组装真核DNA复制叉复制叉（1）激活）激活pre-RC，以起始，以起始DNA复制；复制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-RC。2.Cdk控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cy
39、clin-dependent kinases，CDK）严格控制）严格控制pre-RC的形成和激活。的形成和激活。Cdk功能：功能：在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活，也仅有一次机会激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的因可形成新的pre-RC并迅速结合并迅速结合ORC。但在。但在S、G2和和M期，高活性的期，高活性的Cdk抑制抑制pre-RC的其他组分的其他组分结合结合ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的
40、活性消失，新的的活性消失，新的pre-RC才能形成。才能形成。(六六)端粒酶确保染色体末端复制完整端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链前导链产生产生完整完整的子染色单体。的子染色单体。后随链后随链3 3 端留下端留下缩短的缩短的未复制的未复制的ssDNA区区。端粒（端粒（telomeres）由富含由富含TG的重复序列组成。的重复序列组成。人的端粒重复序列为人的端粒重复序列为5-TTAGGG-3。这些重复序列多为双链，但每个染色体的这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比端比5 端长，形成单链端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。染色体末端复制问题
41、。端粒酶（端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（是一种核糖核蛋白（RNP），），由由RNA和蛋白质组成。和蛋白质组成。端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的组分作为模板，以染色体的3 端端ssDNA（后随链模板）（后随链模板）为引物，将端粒序列添加为引物，将端粒序列添加于染色体的于染色体的3 端。这些新合成的端。这些新合成的DNA为单链为单链。DNA聚合酶聚合酶 ：催化合成催化合成DNA DNA解旋酶（解旋酶（helicase）：）：解开解开DNA双螺旋，暴露双螺旋，暴露复制模板链复制模板链 引发酶引发酶：引发，即合成引发，即合成RNA引物，利用引物引物，利用引物
42、3-OH开始延伸开始延伸 DNA连接酶：连接酶：连结冈崎片段连结冈崎片段 其他酶和蛋白因子其他酶和蛋白因子小结：小结：DNA复制需要多种酶参与复制需要多种酶参与如：起稳定作用的单链如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白结合蛋白（SSB）和改变）和改变DNA超螺旋状态的超螺旋状态的DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase）等）等DNA聚合酶的聚合酶的合成前误差控制合成前误差控制(presynthetic error control)和和校正控制校正控制(proofreading control)功能。功能。细胞修复系统细胞修复系统是是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制高度忠实性的重要
43、因素。复制起始利用引物复制起始利用引物也是确保也是确保DNA复制忠实性的重要复制忠实性的重要机制之一。机制之一。DNA复制具有高度忠实性复制具有高度忠实性 DNA复制是双向复制复制是双向复制 一个起点，两个复制叉，双向复制。一个起点，两个复制叉，双向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。DNA链的合成链的合成3种方式：种方式：线粒体线粒体DNA的的D环（环（D-loop）复制）复制噬菌体的滚环（噬菌体的滚环（rolling circle）复制）复制 三、线粒体和噬菌体三、线粒体和噬菌体DNA复制具有
44、特殊方式复制具有特殊方式（一）（一）线粒体线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制环形、双螺旋环形、双螺旋DNA分子分子两条链一条为重链（两条链一条为重链（H链），另一条为轻链（链），另一条为轻链（L链）链）dNTPDNA-pol 线粒体线粒体DNA分子特点：分子特点：l有特异的复制起点；有特异的复制起点；l环形线粒体环形线粒体DNA两条链（两条链（H和和L）的复制不同步）的复制不同步D环或取代环（环或取代环（displacement loop）：线粒体）：线粒体DNA复制开始以复制开始以H链作为模板合成新的链作为模板合成新的L链，取链，取代原来的代原来的L链并和链并和H链互补，而原来的链互补，
45、而原来的L链则保持链则保持单链状态，形成类似英文字母单链状态，形成类似英文字母D的区域；的区域；l两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；l线粒体线粒体DNA复制也需要复制也需要RNA引物引物。线粒体线粒体DNA复制特点：复制特点：（二）噬菌体（二）噬菌体DNA按滚环方式复制按滚环方式复制环形双螺旋环形双螺旋DNA分子分子一条为模板链，另一条为非模板一条为模板链，另一条为非模板链链E.coli 噬菌体噬菌体DNA的分子结构特点：的分子结构特点：仅以一条链作为模板合成若干环形仅以一条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝分子拷贝噬菌体噬菌体DNA复制的方
46、式是滚环复制复制的方式是滚环复制噬菌体噬菌体DNA复制特点：复制特点：噬菌体噬菌体DNA复制首先由它自己编码的复制首先由它自己编码的A蛋蛋白在白在非模板链非模板链上造成缺口，再以所产生的游离上造成缺口，再以所产生的游离3 端羟基作为引物，并在宿主细胞的端羟基作为引物，并在宿主细胞的DNA聚合聚合酶、解旋酶和酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新链，新蛋白等作用下合成新链，新链和模板链互补并取代了原来的非模板链。这链和模板链互补并取代了原来的非模板链。这种复制方式称为滚环复制种复制方式称为滚环复制。滚环复制：滚环复制：3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5
47、双螺旋双螺旋DNA在复制起点解链不一定导致两条在复制起点解链不一定导致两条链同时复制，也可能利用一条链作为模板起链同时复制，也可能利用一条链作为模板起始始DNA合成。合成。双螺旋双螺旋DNA的两条的两条DNA链的复制起点也可能链的复制起点也可能处于不同的位置。处于不同的位置。滚环复制和滚环复制和D环不对称复制的存在说明：环不对称复制的存在说明：DNADNA的反转录合成的反转录合成Reverse transcription第三节第三节RNA肿瘤病毒肿瘤病毒 DNA原病毒（或前病毒）原病毒（或前病毒）RNA肿瘤病毒肿瘤病毒Temin等提出，原病毒（等提出，原病毒（provirus）DNA是是RNA
48、肿瘤病毒在复制过程中的中间物。肿瘤病毒在复制过程中的中间物。*反转录的发现发展了中心法则反转录的发现发展了中心法则DNA中间模板分子（中间模板分子（mRNA）蛋白质蛋白质中心法则：中心法则：反转录酶的发现发展了中心法则反转录酶的发现发展了中心法则反转录病毒反转录病毒（retroviruses）：RNA病毒，病毒，含有含有反转录酶反转录酶反转录：反转录：在反转录酶的作用下以在反转录酶的作用下以RNA为模板合成为模板合成DNA的过程。的过程。RNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；RNAse H的活性是指它能够从的活性是指它能够从53 和和3
49、5 两个方向水解两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的杂合分子中的RNA。一、一、反转录酶以反转录酶以tRNA为引物合成双链为引物合成双链cDNA反转录酶有反转录酶有3种酶的活性：种酶的活性：反转录酶的结构反转录酶的结构反转录病毒反转录病毒RNA基因组和原病毒基因组和原病毒反转录病毒反转录病毒RNA基因组基因组转变为双链转变为双链cDNA的途径的途径二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动（一）（一）反转录合成双链反转录合成双链cDNA（二）（二）双链双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒插入宿主染色体形成原病毒原病毒或前病毒：原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和
50、反转存在于真核染色体中和反转录病毒录病毒RNA基因组相对应的基因组相对应的双链双链DNA序列。序列。gag基因基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）;pol基因基因编码编码3种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶;env基因基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。（三）原病毒（三）原病毒DNA转录产生病毒转录产生病毒RNA具有自我复制能力的反转录病毒基因组具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有含有3个基因：个基因：直接翻译产生多蛋白直接翻译产生多蛋白Gag和和Gag-Pol。含有包装信号，因此构成完整的病毒
