1、电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。性相反的电极移动的现象。电泳技术电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。的技术。电泳基本原理：电泳基本原理：COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：带电颗粒在电场作用下所受的力：带电颗粒在电场作用下所受的力：电场力电场力 F=XQ阻力阻力 F=6当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动:
2、F=FQX=6/X=Q/61.1.连续系统：连续系统：缓冲液的离子成分、缓冲液的离子成分、PHPH、凝胶浓、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应。2.2.不连续系统：不连续系统：缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pHpH、凝胶浓、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓浓缩效应缩效应、电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应。分类分类分子筛效应：分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而
3、表现出通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷量不同，迁移率不同。（1 1）缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、PHPH的不连续性：的不连续性：电极缓冲液的电极缓冲液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶离子完全电离，有效迁移率大
4、，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。（2 2）凝胶孔径的不连续性：凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶胶中阻力小，速度
5、快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。交界处，因迁移受阻而被压缩。浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应不连续电泳三大效应：不连续电泳三大效应：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）使用含有十二烷基硫酸钠（使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸沸35分钟），通过加热和分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋
6、白基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。质中的二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。垂直板垂直板电泳装置电泳装置加
7、样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。相对迁移率
8、相对迁移率水平式电泳装置水平式电泳装置电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶 等电聚焦电等电聚焦电泳（泳（IFE）利用聚丙烯酰利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电在电场作用下沿电场方向在凝胶内制场方向在凝胶内制造一个造一个pH梯度。梯度。每种蛋白质都每种蛋白质都将迁移至与它的将迁移至与它的pI 相一致的相一致的pH处。处。凝胶中加凝胶中加有两性电有两性电解质溶液解质溶液（pH9-3）加电场后加电场后在凝胶内形在凝胶内形成一个稳定成一个稳定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布 双向
9、电泳双向电泳：等电聚焦电泳等电聚焦电泳：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维经染色后蛋白呈现二维分布图：分布图：水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它们在垂直方向反映出它们在分子量上的差别分子量上的差别。第一向电第一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片单体：丙烯
10、酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）；催化剂：过硫酸胺或核黄素；催化剂：过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶。产物：三维网状结构凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）的聚合反应：的聚合反应：分离胶分离胶(10%10ml10%10ml)浓缩胶浓缩胶(5%10ml)(5%10ml)ddHddH2 2O O4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7
11、mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-HCl 1.25ml10%SDS10%SDS100100l l100100l l10%Ap10%Ap5050l l100100l lTEMEDTEMED1010l l1010l l 配配 胶胶 按下式计算相对迁移率：每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性=蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝区带中心距加样端距离cm 相对迁移率
