1、5-羟色胺2C受体基因多态性与抑郁症的关联2009级研究生 胡茂林 一、概述 抑郁症是一种常见的情感性疾病,指某种不愉快的心境和一定身体器官的功能紊乱,其程度可以从轻度的忧伤到重度的绝望、自杀企图等;是一种常见的精神病理状态或综合征。发病率高、发病年龄广泛,2003年美国的调查研究发现，其终生患病率为16，有重型抑郁发作史的自杀率高达15%。给人们的工作和生活造成了严重的影响,带来了沉重的经济负担。世界卫生组织推测在未来10年内,抑郁症将从疾病负担的第4位上升到第2位。抑郁症已成为全球关注的重要精神心理疾病。名人与抑郁症 泰:在写完安娜卡列尼娜后，托尔斯泰患上了严重的抑郁症。疾病的折磨使他不仅
2、放弃了个人的家庭生活，同时也放弃了文学创作，将精力投入到哲学与宗教的研究，并宣称”艺术不仅是没用的，而且是有害的”。:英国女作家伍尔夫一生被精神分裂折磨，却以她独立特行的强者风范，开了一代意识流小说和散文的先河。她有一种常人不具备的绝妙的头脑，是个天才的“狂人”，她感受到生命的无常，幸福的无常与人生的空虚，以至于精神崩溃，走到了离她家不远的马斯河投水自尽。:苏联作家叶塞宁患有精神抑郁症，1925年12月，他离开莫斯科，与自己的两个孩子吻别后，到了列宁格勒，并在28日凌晨割腕自杀。:1946年获得诺贝尔文学奖的德国作家黑塞，曾遇到特殊的心理压力，引发了严重的抑郁，甚至是精神分裂。1917年前后他
3、介入心理分析，小说荒原狼把他的孤独、不能忍受的分裂用文字的方式表现出来。:曾获1954年诺贝尔文学奖的美国作家海明威，因患抑郁症于1961年在美国开枪自杀。:日本文学界“泰斗级”人物，亚洲第二位获诺贝尔文学奖的作家，1972年4月16日自杀身亡。川端康成自幼失去父母，极为任性孤独和神经质，不爱上学。对于获诺奖后所带来的荣誉和涌来的慕名者，心里十分厌恶，这与幼年的心理封闭有关。他对夫人发脾气“家里并不是旅馆，我也不是为客人活着的”。他对因自杀身亡的古贺春江的口头禅极为赞赏，“再没有比死更高的艺术了。死就是生”。:19岁时，徐迟就在上海现代发表诗作，22岁出版轰动文坛的诗集二十岁人，1981年1月
4、在人民文学发表闻名全国的哥德巴赫猜想。然而在经历爱妻徐松患癌症去世、第二次婚姻破裂等一连串打击后，他开始变得孤僻、沉默，足不出户、闭门独思。后来干脆实行四不政策:不读报、不看电视、不下楼、不会客。他孤独无助，精力衰竭，终于悄无声息地独自走向灵魂的天国。:2007年12月，因丑陋的中国人一文享誉海内外的中国台湾作家柏杨，因患抑郁症，拒绝进食，被家人送往医院救治。:1991年1月4日凌晨，中国台湾女作家三毛在医院被发现自缢而死，生前她曾有严重失眠，幻听幻觉，精神异常(歇斯底里现象)。:以南京大屠杀一书闻名的华裔女作家张纯如，被路人发现用手枪在美国加州洛斯盖多自杀于汽车内时，年仅36岁。张纯如生前经
5、诊断患有忧郁症，曾因病而住院。从南京大屠杀到她准备写的美国二战被俘军人受日军虐待的历史，都是尽显人性恶劣、残忍血腥的历史，给她内心造成极大折磨。这些内容也与张纯如的病因不无关联。:诗人海子也是死于抑郁症，死的方式异常惨烈卧轨自杀。他出身贫寒，生前一无所有，沉迷于诗歌的写作到了痴迷的程度。四任女友都因贫寒先后离他而去。他的诗集是在他死后多年，由好朋友西川帮助整理出版并获得了极大的成功，诗歌界给了他崇高的荣誉，他的才华也渐渐地被世人了解和接受。面朝大海，春暖花开作者:海子从明天起，做一个幸福的人喂马、劈柴，周游世界从明天起，关心粮食和蔬菜我有一所房子，面朝大海，春暖花开从明天起，和每一个亲人通信告
6、诉他们我的幸福那幸福的闪电告诉我的我将告诉每一个人给每一条河每一座山取一个温暖的名字陌生人，我也为你祝福愿你有一个灿烂的前程愿你有情人终成眷属愿你在尘世获得幸福我只愿面朝大海，春暖花开 林肯；罗斯福；丘吉尔；尼克松；达尔文；凡高；玛丽莲梦露；张国荣 这些我们熟知的成功人士，却无一不是在“抑郁症”此迷宫中挣扎，无法解脱。视频二、病因 1.海马体积2.神经元减少及结构破坏3.神经递质 其引发的主要原因是 中枢去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)5-羟色胺（5-HT）多巴胺（DA）这些特定的神经递质的水平过低及其受体功能低下。5-HT是一种单胺类的神经递质,它广泛参与了多种脑的功能,包括
7、情感控制、睡眠和体温的调节、焦虑、药物依赖、摄食和性行为。三、治疗方法 抑郁症的治疗方法可分为:药物治疗、电休克治疗(ECT)、跨颅砸刺激治疗(TMS)、迷走神经刺激治疗(VNS)、睡眠剥夺治疗、光照治疗、精神外科手术治疗以及心理治疗等。主要是药物治疗 药物治疗又分为两大类:中医药治疗和西药治疗。中医治疗有疏肝理气解郁、平肝降火、化痰解郁、益气养血,健脾补心,交通心肾、清心活血、平肝潜阳等法。西药治疗药物很多。主要有十大类药物可供临床选择。1、选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)包括氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林、齐美定和曲唑酮等。这类药目前在临床上已经广泛应用。其特点是口服易吸收,与
8、血浆蛋白结合率高,半衰期长,显效快作用强,副作用较三环类(TCA)少。2、苯基哌嗪衍生物 代表药物有奈法唑酮,它的特点是对5-羟胺具有双重作用,既像SSRI抑制5-羟胺的再摄取,又阻断突触后5-羟色胺2受体,具有抗抑郁和抗焦虑的双重作用。3、5-羟色胺、去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NSRI)此类药通过阻滞去甲肾上腺素和5-羟色胺两种递质的再摄取而发挥抗抑郁作用。无口干、低血压、过度镇静等不良反应,起效快,对重症抑郁症或难活性抑郁症有明显疗效,复发率低。代表药物有文拉法辛,主要用于焦虑性抑郁症,不宜与SSRI或MAOI类药物合用,以免引起高血压、意识障碍,甚至昏迷或死亡4、选择性去甲肾上腺素重摄取
9、抑制剂(去甲肾上腺素RI)代表药物有瑞波西汀,作用与氟西汀相似,据称其比氟西汀能更有效的治疗多种类型的抑郁症并有良好的耐受性和很少的不良反应,可用于抑郁症的长期治疗5、去甲肾上腺素和特定5-羟色胺再摄取抑制剂(NaSSA)其代表药物为米氮平。药理作用是拮抗中枢NA能神经元及末梢突触前膜2受体,促进NA和5-羟色胺的释放,对伴有睡眠障碍、焦虑或恶心的患者具有更高的选择性,不良反应少。国内已有仿制品种。6、氨基酮类 安菲他酮是惟一的上市药,是多巴胺递质的选择性抑制剂,口服吸收率可达80%,血药达峰时间为13小时,半衰期为610小时,经肾脏排泄。适用于对其他抗抑郁药疗效不明显或不能耐受的患者,对睡眠
10、过度的单、双相抑郁尤其有效7、选择性单氨氧化酶抑制剂(MAIO)吗氯贝安是该类药的惟一代表,特点是在体内高度选择性和可逆地抑制A型单胺氧化酶而起抗抑郁作用,对抑郁效果良好8、三环类抗抑郁药 代表药为氯苯帕明,临床上用于治疗老年性抑郁9、四环类 代表药有麦普替林 米舍林 诺米芬辛10、作用于5-羟色胺各受体亚型的药物 对突触后5-羟色胺受体有选择性的激动剂。对树突5-羟色胺白身受体有选择性的拮抗剂。对5-羟色胺1A或5-羟色胺2A具有选择性的拮抗剂。四、临床现状 抑郁症,病程长,且易复发,主要靠药物来治疗或控制,费用高、疗效欠佳、副作用大，无法治愈。五、发病机制 流行病学研究提示:遗传因子在抑郁
11、症发病中起重要的作用。近年来,随着分子生物学技术的广泛应用,人们迫切希望能从基因水平找到抑郁症发生的原因,以期对抑郁症做出早期诊断。近年来国内外抑郁症相关基因的研究进行比较多,包括抑郁症与染色体某些位点的连锁分析,与一些候选基因如5-羟色胺受体基因、多巴胺受体基因、单胺氧化酶基因等的关联分析等。六、连锁分析与关联分析 连锁分析是用微卫星DNA标记对家系定型,根据家系遗传信息中基因间的重组率计算出两基因之间的染色体图距,再根据疾病有无合适的遗传模式,可分别进行参数分析与非参数分析。即通过家系调查来估计两个基因的重组率,从而进行基因定位的方法。关联分析则是在不相关的人群中寻找与性状(疾病或药物反应
12、)相关的染色体区域。如果某一等位基因能增加患某种疾病(如抑郁症)的风险,那么患者中含有这种等位基因的频率应高于正常者,即这一等位基因与该疾病存在着关联。连锁分析由于受到遗传模式和其他因素的影响,对复杂的多基因遗传疾病的研究往往很困难,而关联分析可弥补其缺陷,成为行之有效的方法。对于多基因遗传疾病,主基因效应可由连锁分析测知,而辅基因效应则更多的采用关联分析。七、染色体位点与抑郁症 抑郁症相关基因在1号染色体上的分布最多,其次是2号、6号、11号。在14号、21号、22号以及人Y染色体上尚未见抑郁症相关基因。从染色体区域分布上可知,1p12含有抑郁症相关基因最多,含有Ta2、Ta3、Ta5、Ta
13、6、Ta7、Ta8、Ta9、Ta10、Ta12、Ta13、Ta14、Ta15、TRAR4基因。八、候选基因与抑郁症的关联研究 1、5-羟色胺(5-HT)受体基因与抑郁症的关联研究 5-HT与情感性精神障碍的关联已较早认识到,它能直接或间接调整人的心境。5-羟色胺(5-HT)系统参与情绪、心境、应激等方面的调节,其功能的改变和神经传递异常与抑郁症等精神性疾病发病相关。突触间隙5-HT水平改变及5-HT受体亚型功能的失调则有可能参与抑郁症的发病。1、5-羟色胺(5-HT)受体基因 （1）5-羟色胺1A(5-HT1A)受体基因 （2）5-羟色胺2A(5-HT2A)受体基因 （3）5-羟色胺转运体(5
14、-HTT)基因 （4）色氨酸羟化酶(TPH1)基因 2、多巴胺受体基因 3、单胺氧化酶(MAO)基因 4、DXS7基因座与抑郁症的关联研究 5、儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)基因 6、脑源性神经营养因子(BDNF)基因 7、多巴胺羟化酶(DH)基因 8、信号传导(G3)基因九、我的研究设想 5-羟色胺2C受体基因多态性与抑郁症的关联 关键词：抑郁症 5-HT2C受体基因 多态性 摘要摘要 目的:探讨5-羟色胺2C(5-HT2C)受体基因-759C/T多态性与抑郁症发病机制之间的关系。方法:30例抑郁症患者作为研究组,30名正常者作为对照组,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术及限制性片段长
15、度多态性(RFLP)分别测定所有受试者的5-HT2C受体基因的基因型和等位基因,由于5-HT2C基因位于X性染色体,故对女性个体行基因鉴定,对男性患者只行半合子型鉴定。摘要 预期结果:抑郁症组男性半合子型T、C分布频率,与对照组比较差异有/无显著性(2,P值)。抑郁症组女性基因型TT、CC分布频率与对照组比较差异有/无显著性(2,P值)。抑郁症组T、C等位基因分布频率与对照组比较差异有/无显著性（2,P值)。预测结论:5-HT2C受体基因启动子区-759C/T单核苷酸置换多态性与女性抑郁症的发病机制相关性如何,与男性患者的相关性如何。以及男性、女性之间有何不同。十、结语 目前国内外对抑郁症及其
16、相关基因组的研究尚在探索阶段。由于技术手段的局限性,单个特异性基因作为抑郁症的危险因素的假说尚不能完全被排除,但是构成抑郁症易感性的更大可能是很多无特异性的基因共同作用的结果。大量的研究支持抑郁症是多基因遗传,即这种遗传是由于许多基因的积累作用造成的,没有显性、隐性基因那种明显的传递规律。抑郁症的发生是遗传易感性和环境因素共同作用的结果。十一、展望 新近出现的分子生物学的先进技术-基因芯片技术,为我们研究抑郁症的遗传基础,探索该病的病因和致病机制带来了希望的曙光。这将克服目前仅就抑郁症与一个或几个候选基因之间连锁、关联研究的局限,而是同时进行成千上万个基因与本病之间关联的探索,极大地增加了发现
17、致病基因的几率。此外,cDNA芯片可在基因的表达水平寻找问题,可能更符合抑郁症这种多基因遗传病的特点。相信随着遗传学和分子生物学技术的不断发展,以及人们研究认识层面的不断深入,将有望使抑郁症患者的基因组序列得到比较详尽的分析,从而阐明该病的发病机理,开创抑郁症的生物学诊断和基因水平的治疗,从而达到抗抑郁治疗的高度个体化,为抑郁症的预后提供广阔前景。路漫漫其修远兮吾将上下而求索谢谢备注：一、Stata 是一套提供其使用者数据分析、数据管理以及绘制专业图表的完整及整合性统计软件。它提供许许多多功能，包含线性混合模型、均衡重复反复及多项式普罗比模式。二、HardyWeinberg平衡定律Hardy-
18、Weinberg平衡条件：无限大的群体；随机婚配；没有突变；没有选择；没有迁移；没有遗传漂变（小群体内基因频率随机波动）。结论：群体内一个位点上的基因型频率和基因频率将代代保持不变，处于遗传平衡状态。影响Hardy-Weinberg平衡的因素：突变：自然突变率：u=n x 10-6/配子/位点/代 选择：生殖适合度（f）:为后代提供基因能力的一种量度，以正常的生育力为1作比较。杂合子优势：在某些隐性遗传病中，在特定的条件下杂合子可能比正常纯合子个体更有利与生存而繁殖后代。随机遗传漂变：小群体或隔离的人群中，基因频率的随机波动称为遗传漂变。迁移：不同种族和不同民族的基因频率可有差异。迁移的结果使
19、不同人群通婚，彼此掺入外来基因，导致基因流动，可改变原来群体的基因频率。遗传异质性：由于相似的病理性状（如白化症）可受控于若干不同的基因位点，若不加以严格区分，往往会使Hardy-Weinberg平衡复杂化。奠基者效应：效应是遗传漂变的一种形式，指由带有亲代群体中部分等位基因的少数个体重新建立新的群体，这个群体后来的数量虽然会增加，但因未与其他生物群体交配繁殖，彼此之间基因的差异性甚小。这种情形一般发生于对外隔绝的海岛，或较为封闭的新开辟村落等。在实际应用中，符合理想群体的情况一般是不存在的，但Hardy-Weinberg平衡还是可以应用的，这是因为：我们所调查的群体不可能大到足以显示出这些影
20、响因素；各种影响因素可相互抵消，如突变和选择。三、基因多态性概念多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。基因多态性分类人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为3大类：限制性片段长度多态性（RFL
21、P），即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。这是一类比较普遍的多态性。DNA重复序列的多态性，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，并主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatallite）DNA由1565bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了小卫星DNA长度的多态性。卫星（microsatallite）DNA的基本序列只有18bp，而且通常只重复1060次。单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但
22、更多的是单个碱基的置换，这是目前倍受关注的一类多态性。SNP通常是一种双等位基因的（biallelic），或二态的变异。作为一种碱基的替换，SNP大多数为转换，特别在CG序列上出现最为频繁。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity）。但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多
23、种多样性，生物体所具有的遗传性状称为表型或表现型（phernotype）。生物体所具有的特异基因成分称为基因型（genotype）。表型是基因型与环境因素相互作用的结果。遗传物质是相对稳定的，但是又是可变的，遗传物质的变化以及由其所引起表型的改变，称为突变（mutation）。遗传物质突变包括染色体畸变和基因突变。基因突变是染色体中某一点上发生化学改变，所以又称为点突变（pointmutation）。基因结构和遗传表型的研究是深入了解脂蛋白代谢缺陷症的分子生物学基础，逆向遗传学方法（reversegeneticapproach）则使其有可能在蛋白质水平系统地分析结构和功能的关系。基因多态性的生
24、物学作用：（1）遗传密码的改变：如果基因多态性的碱基的取代、缺失、插入引编码序列的核苷酸顺序改变，在转录和翻译合成蛋白质的过程中，有的对多肽链中氨基酸的排列顺序产生影响，有的不产生影响。可分为：错义突变(missense mutation)指DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由他所编码的氨基酸就变成另一种不同的氨基酸，使得多肽链中氨基酸的顺序也相应地发生改变。无义突变(nonsense mutation)指由于碱基取代使原来可翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子。例如UAU（氨酸）颠换成UAA（终止密码子）使多肽链的合成到此终止，形成一条不完整的多肽链，使蛋白质的生
25、物活性和功能改变。转换也可引起无义突变。同义突变(same sense mutation)指碱基的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，也就是虽然碱基被取代了，但蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代。移码突变(frame-shifting mutation)指在编码序列中单个碱基、数个碱基的缺失或插入，片段的缺失或插入可使突变位点之后的三联体密码子阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质。（2）对mRNA剪接的影响：如果点突变发生内含子的剪切位点，可以产生两种影响：一是原有的剪接位点消失，二是产生新的剪切位点。无论是那一种形式，都可以导致mRNA的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常
26、的表达产物，数个碱基的缺失、片段缺失等匀有可能造成剪接位点的缺失。（3）蛋白质肽链中的片段缺失：无义突变和DNA片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。（4）启动子的突变及非转录区的突变：可以使基因的转录水平或活性的增强或降低。（5）基因多态性的基因型频率分布：在人群中符合Hardy-Wenberg平衡。基因多态性的医学意义：人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性（clinical phenotype diversity），以及对药物治疗的反应性上都
27、起着重要的作用。临床上早期有关基因多态性的研究是从HLA基因开始的，分析基因型在疾病发生易感性方面的作用，如HLA-B27等位基因与强直性脊椎炎发生率的密切关联，可作为诊断的依据。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示人类不同个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。通过对基因多态性与疾病的易感性的联系研究，如P53抑癌基因多态性与肿瘤发生及转移的关系研究，可阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性，不仅为临床医学也为预防医学的发展带来新的领域。疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到重视，如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化，阐明基因型（genotype）与表型(phenotype)之间的
28、联系在认识疾病的发生机理、预测疾病的转归等方面也有重要的作用。药物代谢基因多态性可以影响药物的代谢过程及清除率，从而影响治疗效果。致病基因的多态性使同一疾病不同个体其体内生物活性物质的功能及效应出现差异，导致治疗反应性上悬殊，按照基因多态性的特点用药，将会使临床治疗符合个体化的要求。在疾病基因多态性研究的引导下，临床医生将有可能预断不同的个体在同样的致病条件下会出现什么样的病理反应和临床表现，即临床表型。如高血压的治疗将根据基因多态性的研究选择更具针对性的药物，调整其剂量，而不是不加选择地使用ACEI、钙拮抗剂或交感神经受体阻断剂。合并症的防治也会更个体化，更具针对性。基因多态性的研究对于遗传
29、病具有双重意义，一方面，基因的有害突变，不论是经典的点突变，还是动态突变，其本身就可能是遗传病的病因，另一方面,众多的多态性位点又是很好的遗传标记，可以在遗传病的研究和临床诊断中发挥重要的作用。1.多态性作为遗传病的病因：点突变引起的疾病：从镰刀状细胞贫血开始，突变引起各种遗传病的例子愈来愈多，遗传性肿瘤也逐渐被认识。重复序列多态性作为遗传病的病因：如CCG，CTG和CAG这样的三核苷酸重复序列，当其拷贝数过度增高时可以引起强直性肌营养不良等。三核苷酸拷贝数的扩增或突变发生在世代传递过程中，由于拷贝数在世代间的改变，它被称为动态突变。目前动态突变疾病大多是些神经系统的退行性疾病，也有少数肿瘤。
30、动态突变疾病的发现提示序列拷贝数的多态性能够成为遗传病的病因。2.多态性作为遗传标记的应用：绝大多数DNA多态性并不引起遗传病，但可作为遗传标记来使用。例如：上述提到的各种多态性标记，包括RFLP位点，微卫星和小卫星DNA标记都已广泛用于遗传病的连锁诊断。利用各条染色体上位置已知的众多的多态性标记，通过患病家系的连锁分析，可以找到多基因病的致病基因或相关基因的位置，并为他们的分离克隆提供依据。此外，在疾病的关联分析和病因学研究方面，通过比较患病群体和正常群体，可以发现两组间多态性位点的特定等位基因频率有显著差别，则表明该位点与该疾病相关联。使用多态性标记的关联分析既可以提示相关基因存在的位置，
31、也有助于发病机理的阐明。基因多态性还可以用于疾病的分型与治疗，即根据患者疾病多态性的基因型来解释疾病的病因和临床表现。在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛选。由于基因多态性有明显的种族差异，因此在基因-环境交互作用模式上，不同的种族之间有可能不同。所以，开展我国人群的基因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。而基因多态性的研究在职业病医学中则更具有实际的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工作的效率。对特定的污染物易感
32、人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。四、连锁分析(linkage analysis)和关联分析(association analysis)复杂疾病的基因组分型方法最主要的是采用连锁分析和关联分析,抑郁症也不例外。我们有必要首先了解连锁分析和关联分析技术。细胞中每一对染色体的其中一条是来自父亲,另一条来于母亲。细胞分裂时这两条染色体会发生重组。如果决定两种性能的两个基因在染色体上的位置靠的很近,那么被重组的可能性就比较小,因而可留在同一条染色体上,遗传到下一代。连锁分析是用微卫星DNA标记对家系定型,根据家系遗传信息中基因间的重组率计算出
33、两基因之间的染色体图距,再根据疾病有无合适的遗传模式,可分别进行参数分析与非参数分析。即通过家系调查来估计两个基因的重组率,从而进行基因定位的方法。关联分析则是在不相关的人群中寻找与性状(疾病或药物反应)相关的染色体区域。如果某一等位基因能增加患某种疾病(如抑郁症)的风险,那么患者中含有这种等位基因的频率应高于正常者,即这一等位基因与该疾病存在着关联。连锁分析由于受到遗传模式和其他因素的影响,对复杂的多基因遗传疾病的研究往往很困难,而关联分析可弥补其缺陷,成为行之有效的方法。对于多基因遗传疾病,主基因效应可由连锁分析测知,而辅基因效应则更多的采用关联分析。五、基因芯片技术“微处理器在本世纪使我
34、们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌”。（一）、生物芯片与基因芯片 生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特
35、点。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。鉴于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”,也被称为基因芯片(Gene chip)DNA芯片(DNA chip)。按照载体上点的DNA种类的不同，基因芯片可分为寡核苷酸和cDNA两种芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等等。早在八十年代初期,Bains等人就用杂交的方法对固
36、定在支持物上的短DNA片段进行序列测定。基因芯片技术从实验阶段走向工业化是得益于其他技术的引入，如激光共聚焦显微技术、探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术的结合和双色荧光探针杂交系统的建立。90年代初期人类基因组计划（Human Genome Project,HGP）和分子生物学相关学科的发展也为基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术
37、进入了广泛研究和应用的时期。（二）、制备基因芯片的必要条件1、靶基因 用于芯片点样的是靶基因。靶基因可分为染色体DNA（或基因组DNA）、cDNA（或人工合成DNA）。目前，以cDNA的研究为主，因为cDNA是染色体上编码蛋白质的DNA序列，有医疗和其他领域的研究价值和商业价值。2、制备技术 基因芯片的制备综合了生命科学、化学染料、微电子技术、激光、统计学等领域的前沿技术，主要包括芯片的制备（选择点样仪和玻片、靶基因的扩增和固定）、杂交探针的制备（mRNA的抽提、mRNA的逆转录、PCR和探针荧光标记）、杂交条件的优化技术（杂交液、杂交条件和洗涤条件的选择）和数据分析技术。其中，基因芯片的制备
38、主要依赖于微细加工（microfabrication）、自动化（automatism）及化学合成技术。通常比较典型的DNA芯片制备方法有3种：（1）原位合成法（in situ synthesis）以Affymetrix公司开发的光引导原位合成法为代表（2）合成点样法 又根据是否与芯片的表面接触分为化学喷射法和接触式点涂法，分别以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大学为代表（3）压电法 通过使用4支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位DNA探针合成。（三）、基因芯片技术简介 基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果
39、分析。1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中
40、，减少生物分子之间的错配率。4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。（四）、基因芯片的应用及其商业价值目前，基因芯片技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、
41、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。另外基因芯片在农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将作出重大贡献。基因芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视。鉴于基因芯片的巨大潜力和诱人的前景，基因芯片已成为各国学术界和工业界研究和开发的热点。尤其在美国，正处于人类基因组计划以来的第二次浪潮之中，美国总统克林顿在1998年1月的国情咨文中指出：“在未来的12年内，基因芯片将为我们一生的疾病预防指点迷津”。1998年6月29日美国宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入，以基因芯片为核心的相关产业正在全
42、球崛起，目前美国已有8家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75，专家今统计：全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。美国财富杂志载文：在20世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。鉴于生物芯片技术具有巨大理论意义和实际价值，基因芯片研究在国内也有了很快的发展，例如，复旦大学、中科院上海冶金所、清华大学、联合基因有限公司、军事医学科学院、中科院上海细胞所等单位已在生物芯片技术方面取得了较大突破，相信不久将有我国生产的生物芯片产品投放市场。总之，以基因芯片为代表的生物芯片技术的深入研究和广泛应用，将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响。
