1、第七章第七章酶催化反应酶催化反应 酶是具有酶是具有高度选择性的催化剂高度选择性的催化剂，而一般情况下的酶反，而一般情况下的酶反应均是在温和条件下进行的（如常温、常压和中性溶液），应均是在温和条件下进行的（如常温、常压和中性溶液），酶的这些特性使酶能在酶的这些特性使酶能在食品、饮料和诊断工业食品、饮料和诊断工业中广泛应用。中广泛应用。同样这些特性使酶能在各种同样这些特性使酶能在各种化合物的合成化合物的合成，尤其是在药，尤其是在药物、手性中间体、特殊的聚合物和生化物质合成中显示出了物、手性中间体、特殊的聚合物和生化物质合成中显示出了潜在的吸引力。潜在的吸引力。酶作为一种特殊的催化剂正越来越受到人们
2、的重视，对酶作为一种特殊的催化剂正越来越受到人们的重视，对其应用研究也更趋广泛，从其应用研究也更趋广泛，从生物体系的酶生物体系的酶到到非生物体系的酶非生物体系的酶催化，从催化，从酶的固定化酶的固定化到到非水相酶反应非水相酶反应，酶的潜在能力正获得，酶的潜在能力正获得越来越多的开发和利用。越来越多的开发和利用。7.1 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化7.1.1 酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法固定化酶固定化酶：通过物理或化学的方法将溶液酶转变通过物理或化学的方法将溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到为在一定的空间内其运动受到完全或局部约束完全或局部约束的一的一种种不溶于水不溶于水，但，但
3、仍具活性仍具活性的酶。它能以的酶。它能以固相状态固相状态作作用于底物进行催化反应。用于底物进行催化反应。固定化细胞固定化细胞：将完整的细胞将完整的细胞限定限定在一定空间内活在一定空间内活动的一种固定化生物催化剂。动的一种固定化生物催化剂。注意注意：由于是：由于是具有催化活性的蛋白质具有催化活性的蛋白质的固定化，所以必须严格的固定化，所以必须严格操作条件，尽可能操作条件，尽可能避免酶的高级结构受到损害避免酶的高级结构受到损害。7.1.1 酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法常用方法常用方法：吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、逆胶束包囊法等吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、逆胶束包囊法等常
4、用载体常用载体：活性炭、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙活性炭、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸盐、明胶、合成的高分子化合物等烯酰胺凝胶、海藻酸盐、明胶、合成的高分子化合物等1）吸附法吸附法（最古老、最简便经济）特点：特点：蛋白质与载体之间的蛋白质与载体之间的结合力很弱结合力很弱在很多情况下，酶的非特异性吸附常会引起在很多情况下，酶的非特异性吸附常会引起部部分或全部失活分或全部失活，且高浓度的盐溶液或底物溶液又，且高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的将加速蛋白质的脱附脱附。吸附剂的种类（吸附剂的种类（1）：）：各种各种矿物质矿物质和其他和其他无机载体无
5、机载体：高岭土、多孔玻璃、：高岭土、多孔玻璃、氧化铝、二氧化硅等氧化铝、二氧化硅等蛋白质结合量通常很低蛋白质结合量通常很低纤维素纤维素粉：糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附粉：糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附离子交换剂离子交换剂（目前最常用目前最常用）：羧甲基纤维素、）：羧甲基纤维素、DEAE-纤纤维素、维素、DEAE-葡聚糖以及合成的离子交换剂等葡聚糖以及合成的离子交换剂等作用原理：作用原理：静电吸引静电吸引缺点：当缺点：当离子强度离子强度增加或者增加或者介质的介质的pH、温度、温度改变时，这种改变时，这种结合发生分解。结合发生分解。如果通过化学方法增加酶蛋白上的电荷则如果通过化学方法增加酶蛋
6、白上的电荷则可使这些影响得到改善。可使这些影响得到改善。第一个用于工业生产第一个用于工业生产的固定化酶：的固定化酶：固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶将氨基酰化酶吸附在将氨基酰化酶吸附在DEAE-纤维素或纤维素或DEAE-葡聚糖上制得葡聚糖上制得。吸附剂的种类（吸附剂的种类（2）：）：吸附剂的种类（吸附剂的种类（3）：）：蛋白质载体蛋白质载体：胶原蛋白胶原蛋白是最常用的是最常用的一般胶原蛋白载体预先制成膜状（胶原膜），胶原膜溶一般胶原蛋白载体预先制成膜状（胶原膜），胶原膜溶胀，然后浸入酶溶液，酶渗入膜内并被吸附，制成酶膜。胀，然后浸入酶溶液，酶渗入膜内并被吸附，制成酶膜。生物特异性吸附剂生物特异
7、性吸附剂：如，如，伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A-琼脂糖琼脂糖，可有效地固定一些以可有效地固定一些以糖蛋白为结构的酶糖蛋白为结构的酶。伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A具有凝集红血球细胞和肿瘤细胞的作用，这种作用主要具有凝集红血球细胞和肿瘤细胞的作用，这种作用主要是由于伴刀豆球蛋白是由于伴刀豆球蛋白A能够与细胞表面上的单糖和低聚糖能够与细胞表面上的单糖和低聚糖发生特异性结合。因此，当琼脂糖上结合有伴刀豆球蛋发生特异性结合。因此，当琼脂糖上结合有伴刀豆球蛋白白A 以后，它就能够与溶液中的多糖和糖蛋白发生特异以后，它就能够与溶液中的多糖和糖蛋白发生特异性结合。性结合。2）包埋法包埋法（普适性）包埋法：将酶包裹
8、于包埋法：将酶包裹于凝胶格子凝胶格子或或聚合物半透聚合物半透膜微胶囊膜微胶囊中的方法中的方法特点：特点：酶分子本身不直接参加反应酶分子本身不直接参加反应 条件较条件较温和温和 酶酶活力回收较高活力回收较高 对对底物分子底物分子和和产物分子产物分子的大小的大小有限制，有限制，当当底物底物和产物的相对分子质量小时，扩散阻力就小。和产物的相对分子质量小时，扩散阻力就小。载体（载体（1）：格子型包埋法载体）：格子型包埋法载体常用的：常用的：海藻酸盐、海藻酸盐、K-角叉菜、琼脂、三醋酸纤维角叉菜、琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等素和聚丙烯酰胺凝胶等海藻酸盐海藻酸盐：价格便宜、来源丰富，无毒性，：价格
9、便宜、来源丰富，无毒性，目前应用较广目前应用较广特点特点：操作简便、条件温和操作简便、条件温和在在高浓度的电介质高浓度的电介质（K+、Na+等）溶液中，固定化等）溶液中，固定化颗粒会不稳定；颗粒会不稳定；Ca 2+等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀，固定化颗等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀，固定化颗粒的机械强度将降低，最后重新溶解。因此用此法包埋粒的机械强度将降低，最后重新溶解。因此用此法包埋的固定化酶或细胞的固定化酶或细胞不能用于磷酸缓冲溶液中不能用于磷酸缓冲溶液中。一般操作方法一般操作方法：先将先将海藻酸盐溶于水中海藻酸盐溶于水中，使其具有一定粘度；，使其具有一定粘度；然后然后加入一定量的细胞菌
10、体加入一定量的细胞菌体，并且充分搅拌，使之分，并且充分搅拌，使之分散均匀；散均匀；通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液逐滴注入逐滴注入含有含有Ca 2+、Zn 2+、Al 3+等等多价离子的溶液多价离子的溶液中，由于离中，由于离子转移的胶凝作用，海藻酸盐液滴便形成珠状的固定子转移的胶凝作用，海藻酸盐液滴便形成珠状的固定化细胞颗粒。化细胞颗粒。待颗粒经过一定时间的待颗粒经过一定时间的硬化后洗净硬化后洗净，即可用于催化反，即可用于催化反应。应。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶：蛋白质的固定量较高，：蛋白质的固定量较高，可达可达10100mg/g单体，目前常用的聚合单体，目前
11、常用的聚合物载体物载体特点特点：聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶中孔的大小分布很不均匀孔的大小分布很不均匀，因此，因此要要防止酶的漏失防止酶的漏失。调节单体和交联剂的用量可以调节单体和交联剂的用量可以改善聚丙烯酰胺凝改善聚丙烯酰胺凝胶的渗透性胶的渗透性。操作方法：操作方法：在含酶（或细胞）的水溶液中，加入一定比例的在含酶（或细胞）的水溶液中，加入一定比例的单单体体丙烯酰胺和丙烯酰胺和交联剂交联剂N，N-甲撑双丙烯酰胺；甲撑双丙烯酰胺；然后在然后在催化剂催化剂（二甲氨基丙腈）和（二甲氨基丙腈）和引发剂引发剂（过硫酸（过硫酸钾）的作用下低温（水浴）聚合；钾）的作用下低温（水浴）聚合；产生的聚合物凝胶
12、便是固定化酶，可通过产生的聚合物凝胶便是固定化酶，可通过机械方法机械方法分散分散成一定大小的粒子。成一定大小的粒子。载体（载体（2）：微胶囊包埋材料）：微胶囊包埋材料常用的：常用的：火棉、尼龙、聚脲等火棉、尼龙、聚脲等半渗透的界面聚合物膜半渗透的界面聚合物膜如，将含有如，将含有1,6-二氨基己烷的二氨基己烷的酶水溶液分散酶水溶液分散到与水互不到与水互不相溶的含有己二酰二氯的相溶的含有己二酰二氯的有机溶剂有机溶剂中去，水相与有机相中去，水相与有机相界面上的二胺和二酰氯发生聚合，形成一个包围在水相界面上的二胺和二酰氯发生聚合，形成一个包围在水相酶溶液酶溶液珠滴珠滴外面的外面的聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜（
13、即尼龙（即尼龙-6,6-薄膜）。薄膜）。3）交联法交联法交联法：利用：利用双功能基团试剂双功能基团试剂或或多功能基团试剂多功能基团试剂使酶使酶发生发生分子间交联分子间交联因而得到固定的方法。因而得到固定的方法。常用的试剂：戊二醛、常用的试剂：戊二醛、1,6-亚己基二异氰酸酯、双重亚己基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。马来酸酐共聚物等。双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白蛋白质高级结构的改变质高级结构的改变，使，使酶失活酶失活。常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白辅助蛋白，
14、避免或减少酶在交联过程中因化学修饰造成的失活。避免或减少酶在交联过程中因化学修饰造成的失活。如如牛血清蛋白牛血清蛋白和和明胶明胶等蛋白的加入往往能提高固定化等蛋白的加入往往能提高固定化酶的稳定性。酶的稳定性。3）交联法交联法4）化学共价法化学共价法共价法共价法：使非水溶性载体与酶以：使非水溶性载体与酶以共价键共价键的形式结合。的形式结合。主要方法主要方法：酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰法、重：酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰法、重氮化反应、硅烷基化法等氮化反应、硅烷基化法等特点：特点：结合牢固、半衰期较长结合牢固、半衰期较长 活性回收较低活性回收较低共价偶联反应的选择：共价偶联反应的选择
15、：酶蛋白上酶蛋白上 供共价结合的功能基团供共价结合的功能基团必须不影响酶的必须不影响酶的催化活性催化活性反应条件反应条件尽可能温和尽可能温和最好能在最好能在水溶液水溶液中进行反应中进行反应偶联反应偶联反应对酶蛋白上某一类功能基团有很高的对酶蛋白上某一类功能基团有很高的专专一性一性，而对其他功能基团或水溶液，而对其他功能基团或水溶液几乎无副反应几乎无副反应。7.1.2 酶催化反应的应用实例酶催化反应的应用实例1）在工业及医药上的应用）在工业及医药上的应用食品工业：淀粉制糖、乳品加工、啤酒加工食品工业：淀粉制糖、乳品加工、啤酒加工P238轻工业：丝绸脱胶、原料皮的脱毛轻工业：丝绸脱胶、原料皮的脱毛
16、氨酸酸、有机酸生产：酶法拆分外消旋氨基酸、合成氨酸酸、有机酸生产：酶法拆分外消旋氨基酸、合成氨基酸、合成有机酸氨基酸、合成有机酸医药行业：蛋白酶、胶原酶、链激酶等作为药剂的应医药行业：蛋白酶、胶原酶、链激酶等作为药剂的应用；医疗诊断、分析用；医疗诊断、分析2）酶催化研究的新动态）酶催化研究的新动态基因工程菌产生酶的应用研究基因工程菌产生酶的应用研究酶固定化、修饰后参与酶催化反应的研究酶固定化、修饰后参与酶催化反应的研究在手性化合物拆分中的研究在手性化合物拆分中的研究7.2 微生物转化微生物转化微生物转化，（生物转化微生物转化，（生物转化biotransformation,bioconversi
17、on）微生物微生物的生物转化的生物转化是利用微生物细胞是利用微生物细胞的一种或多种酶，作用于一些化合物的特定部位（基的一种或多种酶，作用于一些化合物的特定部位（基团），使它转变成结构相类似但具有更大经济价值的化团），使它转变成结构相类似但具有更大经济价值的化合物的生化反应合物的生化反应。利用的是完整细胞中的酶的活性。这些细胞可以是活的利用的是完整细胞中的酶的活性。这些细胞可以是活的细胞细胞正在生长的正在生长的或或静态的静态的（细胞分裂很少或根本没（细胞分裂很少或根本没有）细胞，也能使用有）细胞，也能使用干细胞或孢子干细胞或孢子。微生物转化与化学过程相比的优点：微生物转化与化学过程相比的优点：微
18、生物转化在微生物转化在温和的条件温和的条件下进行，化学物质转变成要下进行，化学物质转变成要求的产品，不产生分解，而且节约能源和投资；求的产品，不产生分解，而且节约能源和投资；微生物转化作用于基质分子的专一位置，产生微生物转化作用于基质分子的专一位置，产生立体专立体专一性一性、光学专一性光学专一性产物，不需要化学拆分。产物，不需要化学拆分。微生物转化的发展：微生物转化的发展：20世纪世纪40年代年代，微生物转化领域的研究蓬勃兴，微生物转化领域的研究蓬勃兴起起首先在首先在甾体转化甾体转化方面取得巨大成功，并建立了工方面取得巨大成功，并建立了工业规模的甾体激素转化操作业规模的甾体激素转化操作微生物转
19、化在其他种类生理活性化合物如微生物转化在其他种类生理活性化合物如生物碱、生物碱、抗生素、大麻油和前列腺素合成抗生素、大麻油和前列腺素合成上也得以应用。上也得以应用。7.2.1 微生物转化一般过程微生物转化一般过程（1）制备培养系统（催化剂）制备培养系统（催化剂）p244（2）加入底物）加入底物（3）加入效应物（抑制剂或激活剂）加入效应物（抑制剂或激活剂）（4）保温反应）保温反应（5）监测反应过程）监测反应过程（6）终止反应）终止反应（7）产物分离）产物分离7.2.2 培养系统类型培养系统类型（1）分批培养分批培养：培养基的准备、接种、细胞培养、：培养基的准备、接种、细胞培养、底物加入、保温直至
20、反应完成。底物加入、保温直至反应完成。（2）连续培养连续培养：连续加入新鲜培养基和等速率移：连续加入新鲜培养基和等速率移去消耗了的培养基，使细胞在相对长的周期内维持去消耗了的培养基，使细胞在相对长的周期内维持稳定状态。稳定状态。7.2.2 培养系统类型培养系统类型（3）静息细胞（有生命的、不生长的细胞，静息细胞（有生命的、不生长的细胞，保持许多酶的活性）保持许多酶的活性）：可自由改变反应液中底可自由改变反应液中底物和菌体的比例，反应时间较短，转化生成物中杂物和菌体的比例，反应时间较短，转化生成物中杂质较少，因而分离提纯容易。质较少，因而分离提纯容易。（4）干细胞干细胞：冻干冻干或或丙酮丙酮处理
21、。处理。用干细胞粉的方法与用新鲜静息细胞相同，但干粉用干细胞粉的方法与用新鲜静息细胞相同，但干粉保藏和运输方便。保藏和运输方便。7.2.2 培养系统类型培养系统类型（5）孢子孢子：悬浮在培养基中的孢子能用作生物悬浮在培养基中的孢子能用作生物转化活性相对稳定的来源。方法类似于静息细胞的转化活性相对稳定的来源。方法类似于静息细胞的方法。方法。（6）渗透细胞渗透细胞：用用表面活性剂表面活性剂或或溶剂溶剂处理细胞，处理细胞，改变改变细胞渗透性细胞渗透性。使底物和产物进出细胞更容易。使底物和产物进出细胞更容易。如加入青霉素提高细胞渗透性。如加入青霉素提高细胞渗透性。注意：可能因渗透性的改变而注意：可能因
22、渗透性的改变而影响细胞的生存影响细胞的生存7.2.2 培养系统类型培养系统类型（7）固定化细胞固定化细胞：可以保持活性几个月，比静可以保持活性几个月，比静息细胞催化寿命长，而且可以建立连续转化系统。息细胞催化寿命长，而且可以建立连续转化系统。（8）渗透交联固定化细胞渗透交联固定化细胞：P245先用某些先用某些试剂（多为试剂（多为表面活性剂）表面活性剂）处理细胞，提高处理细胞，提高细胞通透细胞通透性性；然后再进行；然后再进行交联固定化交联固定化。保证保证酶活力破坏酶活力破坏较小，又减少了较小，又减少了传质阻力传质阻力。7.2.3 底物加入底物加入水溶性底物水溶性底物 简单，考虑的是加入的时间和量
23、简单，考虑的是加入的时间和量非水溶性底物非水溶性底物 1.细小细小粉末粉末；2.溶在与水互溶的溶在与水互溶的有机溶剂有机溶剂（常用的有乙醇、丙酮、（常用的有乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜）中；二甲基甲酰胺、二甲基亚砜）中；3.用用表面活性剂表面活性剂来分散不溶性物质来分散不溶性物质7.2.4 微生物转化的类型微生物转化的类型氧化氧化还原还原氨基化氨基化乙酰化和去乙酰化乙酰化和去乙酰化脱氢形成双键脱氢形成双键腈转化成酸腈转化成酸光学专一和立体专一性转化与拆分光学专一和立体专一性转化与拆分7.2.5 微生物转化的应用微生物转化的应用（1）甾体转化）甾体转化（2）-内酰胺类抗生素内酰胺
24、类抗生素（3）维生素）维生素（4）氨基酸）氨基酸（5）生物碱）生物碱（6）其他药物）其他药物（7）化学制品）化学制品7.3 非水相酶催化非水相酶催化传统观点：酶只有在水相中才有活性。传统观点：酶只有在水相中才有活性。20世纪世纪80年代：美国年代：美国MIT的的Klibanov等等 用脂肪酶粉或其固定化酶在几乎无水的有用脂肪酶粉或其固定化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽、手性的醇、酯机溶剂中成功地催化合成了肽、手性的醇、酯和酰胺。和酰胺。有机相酶催化反应研究蓬勃兴起有机相酶催化反应研究蓬勃兴起7.3.1 非水相酶催化的特性非水相酶催化的特性（1）增加非极性）增加非极性基质的溶解度基质
25、的溶解度；（2）使某些原本在）使某些原本在水相不能进行的反应水相不能进行的反应顺利进行，顺利进行，如肽的合成、酯的合成等；如肽的合成、酯的合成等；（3）可减少在）可减少在水相容易发生的副反应水相容易发生的副反应，如酸酐的水，如酸酐的水解、卤化物的水解等；解、卤化物的水解等；（4）容易）容易分离回收分离回收；（5）无微生物污染无微生物污染；缺点：缺点：酶的活性比水相中低酶的活性比水相中低7.3.2 非水相酶催化的相关问题非水相酶催化的相关问题在在完全无水完全无水的情况下，酶是的情况下，酶是无活性无活性的，极少量的的，极少量的水就会激发酶的活性；但含水量低于最适水量时，水就会激发酶的活性；但含水量
26、低于最适水量时，酶会失去催化活性。酶会失去催化活性。有机溶剂有机溶剂可能直接与酶分子水合层中的必须水发可能直接与酶分子水合层中的必须水发生反应，生反应，影响酶的结构和功能影响酶的结构和功能，尤其是极性较强的，尤其是极性较强的溶剂，它可以溶解大量的水，将酶分子水合层中的溶剂，它可以溶解大量的水，将酶分子水合层中的必须水剥离掉，导致酶失活，相对来讲，憎水性溶必须水剥离掉，导致酶失活，相对来讲，憎水性溶剂对水的溶解能力较低，故对酶活和结构影响较小。剂对水的溶解能力较低，故对酶活和结构影响较小。7.3.2 非水相酶催化的相关问题非水相酶催化的相关问题有机溶剂在非水相酶催化中是一个相当重要的因有机溶剂在
27、非水相酶催化中是一个相当重要的因素。素。Lanne等提出了用等提出了用溶剂极性参数溶剂极性参数lgP（P为溶剂为溶剂在正辛醇和水双相体系中的分配系数）来描述溶剂在正辛醇和水双相体系中的分配系数）来描述溶剂极性与酶活的关系。极性与酶活的关系。有机相酶反应中，酶可以有机相酶反应中，酶可以游离形式游离形式直接反应，或直接反应，或固定化固定化在诸如玻璃珠等固体多孔物质上。另外可采在诸如玻璃珠等固体多孔物质上。另外可采用用共价修饰共价修饰（PEG）等方法使酶能溶解在有机溶剂）等方法使酶能溶解在有机溶剂中。中。7.3.3 非水相酶催化的应用非水相酶催化的应用（1）酯的合成和醇、酸、酯的拆分）酯的合成和醇、酸、酯的拆分（2）肽的合成和应用）肽的合成和应用第七章习题第七章习题1.酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法2.微生物转化一般过程微生物转化一般过程3.非水相酶催化的特性非水相酶催化的特性
