1、第三章第三章 基因载体的选择与构建基因载体的选择与构建 一、载体的功能、特征及质粒载体 克隆载体（clony vector）：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。目前基因工程中常用的载体有：细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体等。一）载体的功能一）载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二）载体应具备的特征条件二）载体应具备的特征条件 1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具
2、有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记 多克隆位点多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体基因载体 三）质 粒（plasmid）质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA,ccc DNA）。不是细菌生长所必需的 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 分子量在1-200kb之间 1、质粒的基本特性、质粒的基本特性 （1）自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体 DNA而自主复制 （2）不相容性 同一复制
3、系统的不同质粒在同一细菌中 不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存 （3）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类 松弛型复制 严谨型复制（4）可转移性）可转移性 在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。2、质粒的构建、质粒的构建 （1）天然存在的两种质粒 A、colE1宿主细菌大肠杆菌 6.5kb松弛型复制20-30/cell B、pSC101宿主细菌沙门氏菌 8.8kb严谨型复制5copy/cell（2）质粒人工构建的目的质粒人工构建的目的 天然质粒存在缺陷 不适合用作基因工程的载体 必须对之进行改造构建 方法:重组，“拼拼接接，挖肉补疮”（a）
4、加入合适的选择标记基因（b）增加或减少合适的酶切位点（c）缩短长度，增加装载量 （d）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （e）根据基因工程的特殊要求）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 pBR322为4.36kb的环状双链DNA。例如：例如：pBR322 pBR322 普通型载体普通型载体pBR322的结构图的结构图 pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36 kb)利用抗性基因进行重组子的筛选 重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)
5、DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切3、质粒的制备 实验室一般使用两种方法制备质粒 （1）碱裂解法 （2）沸水浴法 （1）碱裂解法 原理：利用溶菌酶在 NaOH 与SDS的混合溶液中破坏细菌外壁，去除染色体 DNA及变性蛋白质，离心，苯酚氯仿溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。特点：质粒较纯，收得率高，繁琐，且有开环现象 （2）沸水浴法 特点：质粒不纯，收得率低，且制备规模小，但快速，特别适用于重组质粒的鉴定但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。1)用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA DNA 3)连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4)用连接
6、产物转化大肠杆菌感受态细胞 5)涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选 4 4、典型的质粒克隆技术、典型的质粒克隆技术 1）用限制性酶消化限制性酶消化 DNA 样品样品 粘性末端 2）用限制性内切酶消化 质粒DNA 3）连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 冷循环器 4）用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 转化细菌有两个基本方法。一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。5）细菌在加有Amp+X-Gal 的培养基上生长以进行筛选 筛选会有三种结果：一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成；二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落；三
7、是要插入的序列与质粒相连，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。倒平板 Amp+X-Gal+IPTG 培养基的筛选菌落法培养基的筛选菌落法 加IPTG和X-GAL 乳糖和诱导物IPTG的化学结构 isopropyl-beta-D-thio galactopyranoside X-gal X-gal水解 筛选结果?蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的 LacZ序列编码的功能性的 片段?白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上 LacZ序列上有插入片段段 筛选结果模式图 蓝菌落 蓝白菌落 筛选白色菌落 二、噬菌体载体与黏粒载体二、噬菌体载体与黏粒载体 一）噬菌体载体 噬
8、菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和-DNA组成 噬菌体 (电镜图）1、-DNA的物理图谱 -DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT,CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。cos位点的作用 2、感染周期 噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入：（1）吸附 （2）DNA注入 （3）DNA复制（4）包装:只能包装-DNA分子的75%-105%即包装范围为36.4kb-50.9kb 的DNA（5）裂解 吸附吸附 穿入穿入 生物合成 成熟、释放 毒性噬菌体的溶菌性
9、周期 温和噬菌体的溶菌性周期温和噬菌体的溶菌性周期 温和噬菌体的溶源性周期 前噬菌体 噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的 12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长 48 531bp，含50多个基因。二）DNA载体的构建 建立克隆载体前需要解决两个问题：1）DNA分子只能增加5%的大小，即只能插入3kb的DNA分子。2）基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因组。.缩短长度 缩短多余片段提高装载量。（a）插入型载体 （b）取代型载体取代型载体 .修饰酶切识别位点 多余的酶切位点必须被修饰 自然选择法 通过自然选择法筛选无EcorI 识
10、别位点的-噬菌体 三）-DNA的抽提 1)大肠杆菌培养至对数生长期 2)加入-噬菌体或重组-噬菌体悬浮液，37培养1hr 3)用新鲜培养稀释，继续培养 4-12hr 4)高速离心，沉淀噬菌体 5)苯酚抽提，释放-DNA 6)乙醇或异丙醇沉淀 DNA 四）-DNA作为载体的优点 1)体外包装病毒颗粒，高效感染E.coli 2)装载外源能力为25kb，大于质粒 3)筛选方便 4)重组-DNA分子提取容易 五）cos质粒（cosmid）1、cos质粒的构建 cos质粒 含有-DNA两端cos区的质粒 能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb 6kb）载体 组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的 cos位点 Cos质粒pJB8 2、DNA的体外包装 3、考斯质粒的优越性 1)体外包装，高效导入受体细胞 2)装载比质粒或-DNA大得多的外源片段 3)携带质粒的选择标记，便于筛选 4)多种单一酶切位点，便于克隆 Thank You!
