1、生物化学实用技术2012.3胶原蛋白是一种极其重要的结构蛋白，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中。占哺乳动物体内蛋白质总量的25%30%，相当于体重的6%至少有19种不同的类型 一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质通常由3 条多肽链组成，每条链都有左手螺旋结构，三条链绕成右手超螺旋。螺旋区段之外的部分常发生各种交联。每一条链都有若干个典型的氨基酸序列(-Gly-X-Y-)n。X、Y 均表示任意的氨基酸,X 通常是脯氨酸(Pro),Y 通常指羟脯氨酸(Hyp)胶原蛋白中缺少Cys和Try 制造食品止血，促进伤口愈合作为可吸收的支架材料、缝合材料作为药物载体局部整形从胶原蛋白较
2、为丰富的组织（例如皮肤和肌腱）中提取传统来源：猪牛羊皮新兴来源：鱼鳞等问题一：如何从原料中提取蛋白？问题二：如何从蛋白中分离胶原蛋白？问题三：如何检验得到的蛋白是胶原蛋白？前处理粗分级（粗提）细分级（分离纯化）作业一：某一特定蛋白质分离提纯的一般程序是什么？破碎组织细胞，使蛋白更好地与外界条件接触尽量保持蛋白的天然构象和生物活性注意控制条件必要时加入蛋白保护剂可以先将某一细胞组分分离出来动物材料动物材料：除脂肪组织：除脂肪组织-电动捣碎机、匀浆器、电动捣碎机、匀浆器、超声波超声波植物组织植物组织：去种皮：去种皮-石英砂、玻璃粉石英砂、玻璃粉细菌细胞细菌细胞：超声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶：超
3、声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶称取新鲜猪皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切。将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入高速组织捣碎机中捣碎成糊状（12000r/min），用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）充分洗涤以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4OC）。第一步：将蛋白与材料分开，使其进入溶液中酸溶碱溶盐溶酶解注意根据所要提取的蛋白质的性质选择合适的粗分级方法提取胶原蛋白常使用的溶剂是中性盐溶液(0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只适合提取组织中最新合成的胶原
4、以及交联度可以忽略的胶原。稀酸，例如0.5mol/L醋酸，柠檬酸缓冲液，pH值在23之间的盐酸溶液，要比中性盐溶剂更为有效，但仍只能溶解出组织中大约2%的胶原。利用10%的NaOH溶液共同处理组织48h左右，可以溶解出大部分胶原。与不溶性胶原结合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，胶原纤维瓦解。最终所得胶原的大小和分子质量，取决于处理时间以及碱的浓度。酶可以将胶原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水提取胶原蛋白常使用的溶剂是中性盐溶液(0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只适合提取组织中最新合成的胶原以及交联度可以忽略的胶原。稀酸，例如0.5mol/L醋酸，柠檬酸缓冲
5、液，pH值在23之间的盐酸溶液，要比中性盐溶剂更为有效，但仍只能溶解出组织中大约2%的胶原。利用10%的NaOH溶液共同处理组织48h左右，可以溶解出大部分胶原。与不溶性胶原结合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，胶原纤维瓦解。最终所得胶原的大小和分子质量，取决于处理时间以及碱的浓度。酶可以将胶原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水第二步：用简便且处理量大的方法去除无机物等杂质，得到浓缩蛋白质溶液盐析等电点沉淀法有机溶剂沉淀法超滤如蛋白相互差异较大，也可初步分离目标蛋白 可逆沉淀盐析法盐析法(中性盐沉淀法中性盐沉淀法)：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常
6、用中性盐有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：常用与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等，破坏水膜，使其沉淀。蛋白质的等电点：蛋白质的等电点：蛋白质所带蛋白质所带净电荷净电荷为零为零时，所处溶液的时，所处溶液的pHpH 值即为该蛋白质的等电点值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质最不稳定，溶解度最小。利用具有一定大小利用具有一定大小孔径的孔径的微孔滤膜微孔滤膜，对生物大分子溶液对生物大分子溶液进行过滤，使大分进行过滤，使大分子保留在超滤膜上子保留在超滤膜上面的溶液中，小分面的溶液中，小分子物质及水过滤出子物质及水过滤出去，从而达到脱盐去，从而达到脱盐
7、或浓缩的目的。或浓缩的目的。进一步分离纯化目标蛋白质透析超滤凝胶过滤/层析/离子交换色谱密度梯度离心电泳等电聚焦在粗提胶原蛋白溶液中缓慢加入6mol/L NaOH至pH=7，冷冻离心去除沉淀，在上清液中加入NaCl搅拌，4保存过夜；离心取沉淀，用稀HAc溶解，将溶液装入透析袋中，用0.1mol/L 的Hac透析1天，再用蒸馏水透析1天。电泳：带电颗粒在电场中向电荷相反的电电泳：带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象极移动的现象不同的蛋白质颗粒的大小、形状、所带的不同的蛋白质颗粒的大小、形状、所带的电荷、等不同，在电场中的泳动速度各异，电荷、等不同，在电场中的泳动速度各异，因而可聚集形成不同
8、的条带，从而达到分因而可聚集形成不同的条带，从而达到分离的目的。离的目的。层析法：层析法：离子交换层析法离子交换层析法凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法亲和层析法亲和层析法吸附层析法吸附层析法分配层析法分配层析法离子交换层析法离子交换层析法原理原理:根据根据离子交换剂离子交换剂与蛋白质进行离子交换，与蛋白质进行离子交换，再利用适当的缓冲液洗脱，即可达到分离再利用适当的缓冲液洗脱，即可达到分离具有不同电荷性质蛋白质的目的。具有不同电荷性质蛋白质的目的。原理：原理：混合物流经装有凝胶颗粒（凝胶颗粒内混合物流经装有凝胶颗粒（凝胶颗粒内部具有大量一定大小的微孔）的层析柱时，部具有大量一定大小的微孔）的层析柱
9、时，大分子不能进入凝胶孔内，移动较快，并最大分子不能进入凝胶孔内，移动较快，并最先被洗脱出来；小分子能不同程度的自由出先被洗脱出来；小分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移动速度较慢，最后被洗脱出来。动速度较慢，最后被洗脱出来。亲和蛋白亲和蛋白配基配基原理：原理：利用某种蛋白质能与其相应的专一性利用某种蛋白质能与其相应的专一性配基进行特异的可逆结合的能力（亲合力）配基进行特异的可逆结合的能力（亲合力）来纯化生物大分子。来纯化生物大分子。原理：原理：在密度梯度介质（蔗糖或甘油）中在密度梯度介质（蔗糖或甘油）中进行的一种沉降速度离心。混合物加至制进行的一种沉降速度离心。混合物加至制备好的密度梯度介质中，超速离心，各种备好的密度梯度介质中，超速离心，各种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最终形成各自独立梯度时，即停止不前，最终形成各自独立的区带。的区带。
