1、l高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱（High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquide Chromatography）。l第一节第一节 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 l高效液相色谱法具有以下特点。高效液相色谱法具有以下特点。l（1）分离效能高）分离效能高
2、由于新型高效微粒固定相填由于新型高效微粒固定相填料 的 使 用，液 相 色 谱 填 充 柱 的 柱 效 可 达料 的 使 用，液 相 色 谱 填 充 柱 的 柱 效 可 达21035104块块/米理论塔板数，远远高于气相米理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱色谱填充柱103块块/米理论塔板数的柱效。米理论塔板数的柱效。l（2）选择性高）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效，由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及同分异构体，还可分析在性
3、质的有机化合物及同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要的作用。要的作用。（3）检测灵敏度高）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。（4）分析速度快）分析速度快 由于高
4、压输液泵的使用，相对于经由于高压输液泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。时间仅需几分钟到几十分钟。高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化
5、制备。珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。l第二节第二节 高效液相色谱法的分类高效液相色谱法的分类l高效液相色谱法可依据溶质高效液相色谱法可依据溶质(样品样品)在固定相和流动相在固定相和流动相分离过程的物理化学原理分类。分离过程的物理化学原理分类。l(1)(1)吸附色谱吸附色谱(Adsorption Chromatography)用固体用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。l(2)分配色谱分配色谱(Partition Chromatogra
6、phy)用载带在固相基体上用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定；若固定相的极性小于流
7、动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱相色谱(Reversed Phase Chromatography)。l(3)离子色谱离子色谱(Ion Chromatography)用高效微粒离子用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。现分离。l(4)体积排阻色谱体积排阻色谱(Size E
8、xclusion Chromatography)用用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动；以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。l(5)(5)亲和色谱亲和色谱(Aff
9、inity Chromatography)以以在不同基体上，键合多种不同特性的配位体在不同基体上，键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同作固定相，用具有不同pHpH值的缓冲溶液作流值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。子的分离。l第三节第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性高效液相色谱法的应用范
10、围和局限性l 一、应用范围一、应用范围l 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的约占全部有机化合物的8080。其余。其余2020的有机化合的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等
11、分子量物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。的化合物，只能用气相色谱法进行分析。l二、方法的局限性二、方法的局限性l 第第，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。l 第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器型检测器(如热
12、导检测器和氢火焰离子化检测器如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发。近年来蒸发激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱法的一种通用型检测器。法的一种通用型检测器。l 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求柱效高达柱效高达1010万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。l 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在第四，高效液相色谱法
13、也不能代替中、低压柱色谱法，在200kPa200kPa至至1MPa1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。的生化样品。l 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的
14、作用。l第四节第四节 高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪简介l 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品仪器可有如下两种组合方式：仪器可有如下两种组合方式：l 完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高效液相色谱仪总体实用的特点。效液相色谱仪总体实用的特点。l 独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析目的，组装成不同的联接
15、方式。目的，组装成不同的联接方式。l 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，即能控制仪器的操作参数高，即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。的分析工具。1一贮
16、液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数据处理装置)；14一回收废液罐 高效液相色谱仪的组成l一、一、高压输液泵高压输液泵 l对高压输液泵的要求是：对高压输液泵的要求是：l泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢（Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢）或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸、。为防止酸、碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使
17、用碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用由聚醚醚酮由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。材料制成的高压输液泵。l 能在高压下连续工作。通常要求耐压能在高压下连续工作。通常要求耐压4050MPacm-2，能在能在824h连续工作。连续工作。l 输出流量范围宽。对填充柱：输出流量范围宽。对填充柱：0.1l0mLmin(分析型分析型)；1100mLmin(制备型制备型)。对微孔柱：。对微孔柱：101000uLmin(分析分析型型)；19900uLmin(制备型制备型)。l 输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器，输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器，大多数对
18、流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密度应小于度应小于1，最好为，最好为0.5，重复性最好为，重复性最好为0.5。l高压输液泵可以分为如下两类：l 1恒流泵l 恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。l 2恒压泵l 恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。l二、进样装置 l（一）六通阀进样装置l此阀的阀体用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能好。当进样阀手柄置“取样”位置，用特制的平头注射器(10ul)吸取比
19、定量管体积(5ul或l0ul)稍多的样品从“6”处注入定量管，多余的样品由“5”排l出。再将进样阀手柄置“进l样”位置，流动相将样品携l带进入色谱柱。此种进样l重现性好，能耐20MPa高压。l（二）自动进样器l自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按预先编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按预定程序自动进行，一次可进行几十个或上百个样品的分析。自动进样的样品量可连续调节，进样重复性高，适合作大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。但此装置一次性投资很高，目前在国内尚未得到广泛应用。在商品仪器(如HPll00高效液相色谱仪等)中已获广泛使用。l三、三、色
20、色 谱谱 柱柱 l（一）柱材料及规格（一）柱材料及规格l1柱材料柱材料l常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50的的HNO3对对柱内壁作钝化处理。钝化时使柱内壁作钝化处理。钝化时使HNO3在柱管内至少滞留在柱管内至少滞留l0min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。以在内壁形成钝化的氧化物涂层。l2柱规格柱规格l 一般采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为一般采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为4.6mm或或3.9mm，长，长1050cm，填料粒度，填料粒度
21、510um时，柱效达时，柱效达500010000块块m理论塔板数。使用理论塔板数。使用35um填料，柱长可减至填料，柱长可减至5一一l0cm。当使用内径在。当使用内径在0.51.0mm的微孔填充柱或内径为的微孔填充柱或内径为3050um的毛细管柱时，柱长为的毛细管柱时，柱长为1550cm。l 当使用粗内径短柱或细内径长柱时，应注意由于柱内体积当使用粗内径短柱或细内径长柱时，应注意由于柱内体积减小，由柱外效应引起的峰形扩展不可忽视。此时应对进样减小，由柱外效应引起的峰形扩展不可忽视。此时应对进样器、检测器和连接接头作特殊设计以减少柱外死体积。这对器、检测器和连接接头作特殊设计以减少柱外死体积。这
22、对仪器和实验技术提出了更高的要求。但这样会降低流动相的仪器和实验技术提出了更高的要求。但这样会降低流动相的消耗量并提高检测灵敏度。消耗量并提高检测灵敏度。l（二）柱连接方式（二）柱连接方式l柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒，流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒，柱出、入口的连接管的死体积亦柱出、入口
23、的连接管的死体积亦l应愈小愈好，一般常用窄孔应愈小愈好，一般常用窄孔l(内径内径0.13mm)的厚壁的厚壁(1.5l2.0mm)不锈钢管，以减少柱不锈钢管，以减少柱l外死体积。所用柱接头，联外死体积。所用柱接头，联l接螺帽，密接螺帽，密封圈及封圈及色谱柱接色谱柱接l头头皆为不锈钢材料。皆为不锈钢材料。l 1 1一柱接头；一柱接头；2 2一联接柱螺帽；一联接柱螺帽；3 3一接连接管的螺帽；一接连接管的螺帽；l 44孔径孔径0.45um0.45um的纤维素滤膜；的纤维素滤膜；5 5一多孔不锈钢烧结片；一多孔不锈钢烧结片；l 6 6一柱密封圈一柱密封圈(卡套卡套)；7 7一连接管密封圈一连接管密封圈
24、(卡套卡套)；l 8 8一色谱柱管；一色谱柱管；99连接管连接管l（三）柱温控制（三）柱温控制l 在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下几种情况需精确控制柱温：几种情况需精确控制柱温：l 在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。l 必须通过改变柱
25、温来提高分离效率。必须通过改变柱温来提高分离效率。l 对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温。对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温。l 对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室温。温。l 对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温下操作，以实现多组分的完全分离。下操作，以实现多组分的完全分离。l 一个理想的一个理想的HPLC柱温控
26、制系统，如柱温控制系统，如HPll00高效液相色谱仪可高效液相色谱仪可以实现从低于室温以实现从低于室温10至至80柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至仪，其柱温可从室温至150实现精确控温。实现精确控温。l四、四、检检 测测 器器 l高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件(高压输液泵、色高压输液泵、色谱柱、检测器谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一个理想
27、的液相色谱检测器应具备以下特征：个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所灵敏度高；对所有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。l 常用的检测器为紫外吸收检测器常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器、折光指数检测器(RID)、电导检测器、电导检测器(ECD)和荧光检测器和荧光检测器(FD)。l 在高效液相色谱技术发展中，
28、检测器至今是一个薄弱环节，在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节，它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸发激光散射检测器发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用有望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量检测器。灵敏的质量检测器。l(一一)、检测器的分类和响应特性、检测器的分类和响应特性l 1分类分类l (1)按检测的对象分类按检测的对象分类l 整体性质检测器整体性质检测器 检测从色谱柱中流出的流动相
29、总体物理检测从色谱柱中流出的流动相总体物理性质的变化情况。如折光指数检测器性质的变化情况。如折光指数检测器(RID)和电导检测器和电导检测器(CD)，它们分别测定柱后流出液总体的折射率和电导率。此类检测它们分别测定柱后流出液总体的折射率和电导率。此类检测器测定灵敏度低，必须用双流路进行补偿测量；易受温度和器测定灵敏度低，必须用双流路进行补偿测量；易受温度和流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声；不适合于痕量分流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声；不适合于痕量分析和梯度洗脱。析和梯度洗脱。l 溶质性质检测器溶质性质检测器 此类检测器只检测柱后流出液中溶质的此类检测器只检测柱后流出液中溶质的某一物理
30、或化学性质的变化。例如，紫外吸收检测器某一物理或化学性质的变化。例如，紫外吸收检测器(UVD)和荧光检测器和荧光检测器(FD)，它们分别测量溶质对紫外光的吸收和溶，它们分别测量溶质对紫外光的吸收和溶质在紫外光照射下发射的荧光强度。此类检测器灵敏度高，质在紫外光照射下发射的荧光强度。此类检测器灵敏度高，可单流路或双流路补偿测量，对流动相流量和温度变化不敏可单流路或双流路补偿测量，对流动相流量和温度变化不敏感。但不能使用对紫外线有吸收的流动相。感。但不能使用对紫外线有吸收的流动相。l它们可用于痕量分析和梯度洗脱。它们可用于痕量分析和梯度洗脱。l(2)按适用性分类按适用性分类l 选择性检测器选择性检
31、测器 它对不同组成的物质响应差别极它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外吸收检大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外吸收检测器、荧光检测器和电导检测器。测器、荧光检测器和电导检测器。l 通用型检测器通用型检测器 它对大多数物质的响应相差不大，它对大多数物质的响应相差不大，几乎适用于所有物质。折光指数检测器属于通用型检几乎适用于所有物质。折光指数检测器属于通用型检测器，但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时测器，但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时有一定局限性。有一定局限性。l 上面提到的上面提到的UVD、RID、FD、ECD四种检测器皆属四种检测器皆属于非
32、破坏性检测器，样品流出检测器后可进行馏分收于非破坏性检测器，样品流出检测器后可进行馏分收集，并可与其它检测器串联使用。对荧光检测器因测集，并可与其它检测器串联使用。对荧光检测器因测定中加入荧光试剂，其对样品会产生玷污，当定中加入荧光试剂，其对样品会产生玷污，当串联使串联使用时应将它放在最后检测。用时应将它放在最后检测。l2检测器的性能指标检测器的性能指标l性能性能 检测器检测器l 紫外检测器紫外检测器 折光检测器折光检测器 荧光检测器荧光检测器 电导检测器电导检测器l测量参数测量参数 吸光度吸光度 折光指数折光指数 荧光强度荧光强度 电导率电导率l类型类型 选择性选择性 通用性通用性 选择性选
33、择性 选择性选择性l线性范围线性范围 105 104 103 104 l最小检出浓度最小检出浓度 10-10 10-7 10-11 10-3l最小检出量最小检出量 1ng 1ug 1pg 1mgl梯度洗脱梯度洗脱 可以可以 不可以不可以 可以可以 不可仪不可仪l对流量敏感性对流量敏感性 不敏感不敏感 敏感敏感 不敏感不敏感 敏感敏感l对温度敏感性对温度敏感性 低低 10-4 低低 2%/l(二二)、常用检测器、常用检测器l1.紫外吸收检测器紫外吸收检测器(ultravioletabsorptiondetector，UVD)l是高效液相色谱仪中使用最广泛的一种检测器，它分为固定是高效液相色谱仪中
34、使用最广泛的一种检测器，它分为固定波长，可变波长和二极管阵列检测三种类型波长，可变波长和二极管阵列检测三种类型 l（1 1）固定波长紫外吸收检测器）固定波长紫外吸收检测器l 固定波长紫外吸收检测器，由低压汞灯提供固定波长固定波长紫外吸收检测器，由低压汞灯提供固定波长254nm(254nm(或或=280nm)=280nm)的紫外光的紫外光。l l（2）可变波长紫外吸收检测器）可变波长紫外吸收检测器l此检测器采用氘灯作光源，波长在此检测器采用氘灯作光源，波长在190600nm范围内可连续范围内可连续调节。调节。1。氘灯；2。聚光透镜；3。可旋转组合滤光镜；4。入口狭缝；5。反射镜；6。光栅；7。反
35、射镜；8。光分束器；9。样品流通池；10。测量光电二极管；11。参比光电二极管1-流通池；2测量臂；3参比臂；4入射光l（3 3）光二极管阵列检测器）光二极管阵列检测器 (photodiode(photodiodearray detectorarray detector，PDAD)PDAD)是上个世纪是上个世纪8080年代发年代发展起来的一种新型紫外吸收检测器。它与普展起来的一种新型紫外吸收检测器。它与普通紫外吸收检测器的区别在于进入流通池的通紫外吸收检测器的区别在于进入流通池的不再是单色光，获得的检测信号不是在单一不再是单色光，获得的检测信号不是在单一波长上的，而是在全部紫外光波长上的色谱波
36、长上的，而是在全部紫外光波长上的色谱信号。因此它不仅可进行定量检测，还可提信号。因此它不仅可进行定量检测，还可提供组分的光谱定性的信息。供组分的光谱定性的信息。l2.折光指数检测器折光指数检测器l折光指数检测器折光指数检测器(refractiveindexdetector，RID)又称示又称示差折光检测器差折光检测器(DRD)，它是通过连续监测参比池和测量池，它是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。由于每种中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。由于每种物质都具有与其他物质不相同的折射率，因此物质都具有与其他物质不相同的折射率，因此RID是一种是一种通用型检测
37、器。通用型检测器。l此类检测器一般不能用于梯度洗脱，因为它对流动相组成此类检测器一般不能用于梯度洗脱，因为它对流动相组成的任何变化都有明显的响应，会干扰被测样品的监测。的任何变化都有明显的响应，会干扰被测样品的监测。l此检测器的普及程度仅次于紫外吸收检测器。折光指数检此检测器的普及程度仅次于紫外吸收检测器。折光指数检测器对温度变化敏感，使用时温度变化要保持在测器对温度变化敏感，使用时温度变化要保持在0.001 0.001 范围内。此检测器对流动相流量变化也敏感，其灵敏度范围内。此检测器对流动相流量变化也敏感，其灵敏度较低，不宜用于痕量分析。较低，不宜用于痕量分析。l3.3.电导检测器电导检测器
38、l电导检测器电导检测器(electrical conductivity detector(electrical conductivity detector，ECD)ECD)是是一种选择性检测器，用于检测阳离子或阴离子，其在离子色一种选择性检测器，用于检测阳离子或阴离子，其在离子色谱中获得广泛应用。由于电导率随温度变化，因此测量时要谱中获得广泛应用。由于电导率随温度变化，因此测量时要保持恒温。它不适用于梯度洗脱。保持恒温。它不适用于梯度洗脱。l4.荧光检测器荧光检测器l 荧光检测器（荧光检测器（fluorescence detector,FDfluorescence detector,FD）是利
39、用某些）是利用某些溶质在紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来进行溶质在紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来进行检查的。它是一种具有高灵敏度和高选择性的检测器。对不检查的。它是一种具有高灵敏度和高选择性的检测器。对不产生荧光的物质，可使其与荧光试剂反应，制成可发生荧光产生荧光的物质，可使其与荧光试剂反应，制成可发生荧光的衍生物再进行测定。的衍生物再进行测定。l荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器高荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器高100100倍，当要对痕倍，当要对痕量组分进行选择性检测时，它是一种有力的检测工具。但它量组分进行选择性检测时，它是一种有力的检测工具。但它的线性范围较窄，
40、不宜作为一般的检测器来使用的，可用于的线性范围较窄，不宜作为一般的检测器来使用的，可用于梯度洗脱。测定中不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂梯度洗脱。测定中不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相。对不能直接产生荧光的物质，要使用色谱柱后衍作流动相。对不能直接产生荧光的物质，要使用色谱柱后衍生技术，操作比较复杂。此检测器现已在生物化工、临床医生技术，操作比较复杂。此检测器现已在生物化工、临床医学检验、食品检验、环境监测中获得广泛的应用。学检验、食品检验、环境监测中获得广泛的应用。l5.蒸发激光散射检测器蒸发激光散射检测器l在高效液相色谱分析中，人们一直希望能有一在高效液相色谱分析中，人们一
41、直希望能有一台像台像FID那样的通用型质量检测器，它能对各那样的通用型质量检测器，它能对各种物质均有响应，且响应因子基本一致，它的种物质均有响应，且响应因子基本一致，它的检测不依赖于样品分子中的官能团，且可用于检测不依赖于样品分子中的官能团，且可用于梯度洗脱。目前最能接近满足这些要求的就是梯度洗脱。目前最能接近满足这些要求的就是蒸发激光散射检测器蒸发激光散射检测器(evaporation laser scattering detector，ELSD)。l下图为蒸发激光散射检测器工作原理示意图。色谱柱后流出下图为蒸发激光散射检测器工作原理示意图。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气物在通向
42、检测器途中，被高速载气(N2)喷成雾状液滴。在受喷成雾状液滴。在受温度控制的蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，溶质形成不挥温度控制的蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，溶质形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测系统。检测系统由一个发的微小颗粒，被载气载带通过检测系统。检测系统由一个激光光源和一个光二极管检测器构成。在散射室中，光被散激光光源和一个光二极管检测器构成。在散射室中，光被散射的程度取决于散射室中溶质颗粒的大小和数量。粒子的数射的程度取决于散射室中溶质颗粒的大小和数量。粒子的数量取决于流动相的性质及喷雾气体和流动相的流速。当流动量取决于流动相的性质及喷雾气体和流动相的流速。当流动相和喷雾气体的
43、流速恒定时，散射光的相和喷雾气体的流速恒定时，散射光的l强度仅取决于溶质的浓度。此检测器可强度仅取决于溶质的浓度。此检测器可l用于梯度洗脱。用于梯度洗脱。且响应值仅与光束中溶且响应值仅与光束中溶l质颗粒的大小和数量有关，而与溶质的质颗粒的大小和数量有关，而与溶质的l化学组成无关化学组成无关。l1-HPLC1-HPLC柱；柱；2-2-喷雾气体；喷雾气体；3-3-蒸发漂移管；蒸发漂移管；4-4-样品液滴；样品液滴；l 5-5-激光光源；激光光源；6-6-光二极管检测器；光二极管检测器；7-7-散射室散射室 l6.6.色谱数据处理装置色谱数据处理装置 l(1)(1)微处理机微处理机 l(2)(2)色
44、谱工作站色谱工作站 l主要功能为：主要功能为：l 自行诊断功能自行诊断功能 可对色谱仪的工作状态进行自行诊断，并能用可对色谱仪的工作状态进行自行诊断，并能用模拟图形显示诊断结果，可帮助色谱工作者及时判断仪器故障并予模拟图形显示诊断结果，可帮助色谱工作者及时判断仪器故障并予以排除。以排除。l全部操作参数控制功能全部操作参数控制功能 色谱仪的操作参数，如柱温、流动相色谱仪的操作参数，如柱温、流动相流量、梯度洗脱程序、检测器灵敏度、最大吸收波长、自动进样器流量、梯度洗脱程序、检测器灵敏度、最大吸收波长、自动进样器的操作程序、分析工作日程等，全部可以预先设定，并实现自动控的操作程序、分析工作日程等，全
45、部可以预先设定，并实现自动控制。制。l智能化数据处理和谱图处理功能智能化数据处理和谱图处理功能 可由色谱分析获得色谱图，打可由色谱分析获得色谱图，打印出各个色谱峰的保留时间，峰面积、峰高、半峰宽，并可按归一印出各个色谱峰的保留时间，峰面积、峰高、半峰宽，并可按归一化法、内标法、外标法等进行数据处理，打印出分析结果。谱图处化法、内标法、外标法等进行数据处理，打印出分析结果。谱图处理功能包括谱图的放大、缩小，峰的合并、删除、多重峰迭加等。理功能包括谱图的放大、缩小，峰的合并、删除、多重峰迭加等。使用专用的多种色谱参数的计算和绘图软件，可计算柱效、分离度、使用专用的多种色谱参数的计算和绘图软件，可计
46、算柱效、分离度、KovatsKovats保留指数、拖尾因子，并可绘制标准工作曲线、范第米特曲保留指数、拖尾因子，并可绘制标准工作曲线、范第米特曲线，还可进行仿真模拟等操作。线，还可进行仿真模拟等操作。l进行计量认证的功能进行计量认证的功能 工作站储存有对色谱仪器性能进行工作站储存有对色谱仪器性能进行计量认证的专用程序，可对色谱柱控温精度、流动相流量精计量认证的专用程序，可对色谱柱控温精度、流动相流量精度、氘灯和氙灯的光强度及使用时间、光吸收波长校正、检度、氘灯和氙灯的光强度及使用时间、光吸收波长校正、检测器噪声、自动进样器的线性等进行监测，并可判定是否符测器噪声、自动进样器的线性等进行监测，并
47、可判定是否符合计量认证标准。合计量认证标准。l控制多台仪器的自动化操作功能控制多台仪器的自动化操作功能 HP DOS色谱工作站，可色谱工作站，可控制四套控制四套HPLC系统，并完成全部系统，并完成全部HPLC方法的设定、运行、方法的设定、运行、打印报告及串联运行，并可与打印报告及串联运行，并可与INTERNET连接进行数据传输连接进行数据传输或仪器远程诊断。或仪器远程诊断。l网络运行功能网络运行功能 用一台高档微型计算机，配备用用一台高档微型计算机，配备用Windows NT构成的专用软件，作为服务器构成的专用软件，作为服务器(Server)，可将同一实验室，可将同一实验室的色谱工作站连成局域
48、网络。服务器使用两种专用软件，一的色谱工作站连成局域网络。服务器使用两种专用软件，一种是从事实验室管理的种是从事实验室管理的Chem Access软件，它可传输或交换软件，它可传输或交换数据、监控仪器的工作状态，以提高工作效率。另一种是具数据、监控仪器的工作状态，以提高工作效率。另一种是具有数据库功能的有数据库功能的Chem Store软件，它可对数据进行归纳、统软件，它可对数据进行归纳、统计处理、分类。服务器也可与计处理、分类。服务器也可与INTERNET连接，构成广域网连接，构成广域网络。络。l第五节第五节 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 l高效液相色
49、谱法用于未知样品的分离和分析，主要采用吸附色高效液相色谱法用于未知样品的分离和分析，主要采用吸附色谱、分配色谱、离子色谱和体积排阻四种基本方法；对生物分谱、分配色谱、离子色谱和体积排阻四种基本方法；对生物分子或生物大分子样品还可采用亲和色谱法。子或生物大分子样品还可采用亲和色谱法。l 当用高效液相色谱去解决一个样品的分析问题时，往往可选当用高效液相色谱去解决一个样品的分析问题时，往往可选择几种不同的择几种不同的HPLC方法，而不可能仅用一种方法，而不可能仅用一种HPLC方法去解方法去解决各式各样的样品分析问题。决各式各样的样品分析问题。l 一种高效液相色谱分析方法的建立，是由多种因素来决定的，
50、一种高效液相色谱分析方法的建立，是由多种因素来决定的，除了了解样品的性质及实验室具备的条件外，对液相色谱分离除了了解样品的性质及实验室具备的条件外，对液相色谱分离理论的理解、对前人从事过的相近工作的借鉴以及分析工作者理论的理解、对前人从事过的相近工作的借鉴以及分析工作者自身的实践经验，都对分析方法的建立起着重要的影响。自身的实践经验，都对分析方法的建立起着重要的影响。l 通常在确定被分析的样品以后，要建立一种通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：l 根据被分析样品的特性选择适用于样品分根据被分析样品的特性选择适用于样品
