1、第一节第一节 定向进化简介定向进化简介第二节第二节 定向进化的应用定向进化的应用第三节第三节 蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性第四节第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理蛋白质不可逆失活的原理和机理一理论来源二概念三定向进化的策略 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 化学进化 生物进化：达尔文在物种起源中提出以自然选择为基础的进化学说，成为生物学史上的一个转折点。自然进化 环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展 漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组，产生了遗传多样性 自发、非常缓慢、自然选择 人为引发、较短时间、人为选择？人为引发、较短时间、人为选择？定向进化对酶实现定向进化的意
2、义对酶实现定向进化的意义 酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。酶分子改造 合理化设计：（需要获得酶分子特征、空间结构、结构与功能之间的关系等信息）比如，化学修饰，定点突变 非合理化设计：定向进化，杂化进化 定向进化随机突变随机突变+定向选择目标突变体定向选择目标突变体细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温
3、度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提高了！最适生长温度提高了！属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、突变、重组和筛选，重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）定向进化的过程 酶定向进化通常分3步进行：.通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；2.导入适当载体后构建突变文库；3.通过灵敏的
4、筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。定向进化：突变定向进化：突变 筛选筛选 突变位点是随机的，不确定的；突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；
5、突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以定点突变的方法一般是以PCRPCR技术为基础的。技术为基础的。定向进化的策略无性进化:易错PCR、化学诱变剂介导的随机诱变、由致突变菌株产生的随机突变有性进化:DNA改组技术、随机引物体外重组法、交错延伸法(一)易错PCR(error-prone PCR)一种相对简单、快速廉价的随机突变方法。通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。关键是控制DNA的突变频率。易错PCR的不足之处在于：靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；中性突变较多；且较为耗时、费力 获得的DNA序列中碱基的转
6、换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。连续易错PCR(Sequential error-prone PCR)该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。（二）DNA改组技术(DNA shuffling)又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。分子育种 基因家族改组技术(family shuffling)体体外外定定向向进进化化单个基因的DNA改组 从突变体基因库中分离出来的DNA
7、片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割 得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环 在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组DNA改组原理 1.DNaseI 产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 概念：来源于不同基因的两个或多个外显子异位性地被组合在一起，或是一个相同的外显子通过复制创造了一个新的外显子内含子结构。外显子改组类似于DNA改组，与其不同，它是靠一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段。（四）随机引物体外重组法(RPR)概念：
8、是以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，他们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因片段。点击返回一提高酶分子的催化活力二提高酶分子的稳定性三提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化五对映体选择性的定向进化六变换催化反应专一性 L天冬氨酸酶定向进化研究 进行4轮易错PCR，每一轮筛选了3000个菌落。得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶 该突变体共发生了7个碱基突变，其中3 个碱基突变引起了氨基酸的改变。T4溶菌酶11个
9、不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4.8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2 有两组实验进化了谷胱甘肽转移酶 Gulick分离到了一株谷胱甘肽转硫酶（药物解毒酶），对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍 Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功 S型选择性的转氨酶转化-丁酮，仅有65%的手性专一性。通过10 000个随机突变的菌株的筛选，获得10个手性专一性在80%-94%之间的酶 来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物的S型的选择性达到
10、81%点击返回蛋白质稳定性的分子原因测定蛋白质稳定性的方法金属离子、底物、辅因子和其他相对分子质量配体的结合作用蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用盐桥和氢键二硫键 图一 图二对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低氨基酸残基的坚实装配疏水相互作用 点击返回 点击返回 点击返回 点击返回参数度量如何测定Tm熔化温度实验变性剂浓度50%变性所需的变性剂浓度实验G(H2O)构象稳定性变性剂伸展曲线G(25)构象稳定性热变性曲线Ts最大稳定性温度稳定性曲线相对活力/%时间t时保留的活力实验加速降解试验预测温度T时的寿命阿伦尼乌斯图 点击返回1.蛋白水解酶和自溶作用2.聚合作用3.极端pH4.氧化作用5.表面活性剂和去污剂6.变性剂7.重金属离子和巯基试剂8.热9.机械力10.冷冻和脱水11.辐射作用 点击返回
