1、体外放射分析体外放射分析山西医科医科大学第一医院核医学科山西医科医科大学第一医院核医学科定义：定义：全称全称体外放射配体结合分体外放射配体结合分析析-指在体外条件下，以放射性核素指在体外条件下，以放射性核素标记的配体为示踪剂，以结合反应为基标记的配体为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，对微量础，以放射性测量为定量手段，对微量活性物质进行定量分析的一类检测技术活性物质进行定量分析的一类检测技术的总称。的总称。配体配体-能与结构上某一部位起互补结能与结构上某一部位起互补结合的分子或化合物，如抗体、抗原，受合的分子或化合物，如抗体、抗原，受体、蛋白激素体、蛋白激素基本定义 抗原的概念
2、抗原的概念抗原抗原（antigen,Ag)antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质。抗原的两种特性：抗原的两种特性：免疫原性和抗原性免疫原性免疫原性（immunogenicityimmunogenicity),能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。抗原性抗原性（antigenicityantigenicity),能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。基本定义基本定义|半抗原半抗原-|抗体抗体（Antibody,AbAntibody,Ab）是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所
3、产生的一类能和相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。主要内容一一.概述概述 基本试剂 基本原理 操作过程 分离技术 质量控制 三免疫放射分析（三免疫放射分析（IRMAIRMA）四四.非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术酶免疫分析（EIAEIA）化学发光免疫分析（CLIACLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIATrFIA）二二.放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）1.历史回顾历史回顾19591959年年BersonBerson、YalowYalow开创了放射免疫分析。开创了放射免疫分析。于于19771977年荣获诺贝尔生物医学奖。年荣获诺贝尔生物医学奖。19601960年
4、年EkinsEkins建立了竞争蛋白结合分析法。建立了竞争蛋白结合分析法。19681968年年MilesMiles和和HalesHales建立了免疫放射分析。建立了免疫放射分析。近年来化学发光、电子化学发光、荧光时间近年来化学发光、电子化学发光、荧光时间分辨等非放射性标记免疫分析自动化技术先分辨等非放射性标记免疫分析自动化技术先后问世，检测灵敏度提高到了后问世，检测灵敏度提高到了10101515g g。2.2.类型：类型：（据特异性结合试剂的不同分类）据特异性结合试剂的不同分类）放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）1959 1959 竞争性蛋白结合分析（竞争性蛋白结合分析（CPBACPB
5、A）19631963免疫放射分析（免疫放射分析（IRMAIRMA）19681968放射受体分析（放射受体分析（RRA RRA）7070年代年代 放射酶学分析放射酶学分析 7070年代年代放射微生物分析放射微生物分析 其他非放射性标记免疫分析：其他非放射性标记免疫分析：PACIAPACIA主主要要内内容容一一.概述概述 基本试剂 基本原理 操作过程 分离技术 质量控制 三免疫放射分析（三免疫放射分析（IRMAIRMA）四四.非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术酶免疫分析（EIAEIA）化学发光免疫分析（CLIACLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIATrFIA）二二.放射免疫分析（
6、放射免疫分析（RIARIA）放射免疫分析（放射免疫分析（RIA)（Radioimmunoassay RIA）基本试剂基本试剂 基本原理基本原理操作过程操作过程分离技术分离技术质量控制质量控制RIARIA主要内容主要内容RIARIA定义定义是利用标记是利用标记抗原抗原和非标记抗原和非标记抗原竞争结合竞争结合其特异抗体，给予充分的时间，使反应达其特异抗体，给予充分的时间，使反应达到平衡，然后分离并分别测定结合的到平衡，然后分离并分别测定结合的抗原抗原抗体复合物抗体复合物放射性（放射性（B B）和游离抗原和游离抗原放射性放射性（F F）来计算出非标记抗原含量的一种超微来计算出非标记抗原含量的一种超微
7、量分析技术。量分析技术。RIARIA基本试剂基本试剂1 1、标记抗原、标记抗原 125125I I 多数多数 闪闪 价廉价廉 3 3H H 少数少数 液闪液闪 费用高费用高 *AgAg的质量要求：的质量要求：标记后不改变原有抗原的生物活性；标记后不改变原有抗原的生物活性；标记的放射性核素的标记的放射性核素的t t1/21/2不能太短；不能太短；比活度和放化纯度足够高，保证分析比活度和放化纯度足够高，保证分析的灵敏度。的灵敏度。125125I I的特性：的特性：碘元素共有碘元素共有2929种同位素，其中种同位素，其中2323种放种放射性核素，射性核素，125125I I最为常用，优点：最为常用，
8、优点：半衰期适中（半衰期适中（6060天），易于商品化和储存，天），易于商品化和储存，也利于废物处理；也利于废物处理；只发射只发射28keV 28keV 线和线和35keV 35keV 射线（无射线（无），），容易测量，辐射自分解少，标记物足够稳定；容易测量，辐射自分解少，标记物足够稳定；化学性质活泼，标记容易，可得到多种标记化学性质活泼，标记容易，可得到多种标记物而广泛应用。物而广泛应用。2、标准抗原（标准品）标准抗原（标准品）是已知含量并呈梯度浓度的系列是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，作标准曲线用。标准抗原，作标准曲线用。要求：要求：保证与被测物具有相同的免疫活保证与被测物具有相同的
9、免疫活性和相同介质。性和相同介质。RIARIA基本试剂基本试剂 RIA使用使用：多克隆抗体：多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体RIARIA基本试剂基本试剂衡量抗体质量的指标是衡量抗体质量的指标是亲和力亲和力:抗体结合的强度抗体结合的强度特异性特异性:不不受交叉反应物质影响的程度受交叉反应物质影响的程度滴度滴度:抗体的效价抗体的效价抗体实际应用时的稀释倍数，滴度越高，所需的抗血清量越少，血清的稀释倍数越高，抗血清中杂质干扰也少。一般滴度高到1：1000以上，血清中干扰物质影响就很小。RIARIA基本原理基本原理 最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗体结合
10、的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的体结合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的基础上的。基础上的。Ag Ag AbAb AgAbAgAb *Ag Ag *AgAbAgAb 动态平衡体系中，动态平衡体系中，*AgAg与与AgAg具有同样的免疫活性和结具有同样的免疫活性和结合反应能力，当合反应能力，当*AgAg和和AbAb的量恒定，且的量恒定，且Ag+Ag+*AgAg的分的分子数子数抗体的分子数抗体的分子数，*AgAg与与AgAg相互竞争同相互竞争同AbAb结合，结合，彼此抑制，待测彼此抑制，待测AgAg与与*AgAbAgAb呈负相关函数关系。呈负相关函数关系。0.670.3310.500.5
11、020.50.330.670.20.170.83竞争放射分析原理示意图竞争放射分析原理示意图0 5 10 15 20B/F2.52.01.51.00.50.0剂量-标准抗原浓度剂量-标准抗原浓度0 5 10 15B/B0%100 50 0待测待测AgAg与与*AgAbAgAb呈负相关函数关系呈负相关函数关系RIARIA操作过程操作过程配制已知浓度系列标准抗原（配制已知浓度系列标准抗原（AgAg）-现现多由厂家提供已配置好的标准品多由厂家提供已配置好的标准品加待测抗原（加待测抗原（AgAg）和抗体（）和抗体（AbAb）-温育温育加标记抗原（加标记抗原（*AgAg）和抗体（）和抗体（AbAb）-温
12、育温育分离复合物分离复合物*AgAbAgAb（B B）和游离）和游离*AgAg（F F）用用计数器计数器测量放射性计数测量放射性计数根据标准曲线或计算机直接算出根据标准曲线或计算机直接算出1.样品或标准品2.标记物3.抗血清混匀温浴分离剂混匀立即1.加样2.加分离剂3.离心4.去上清分离5.测量RIARIA分离技术分离技术目的：将游离目的：将游离*Ag Ag 和和*AgAbAgAb有效分离。有效分离。小分子小分子大分子大分子活性炭吸附法活性炭吸附法聚乙二醇聚乙二醇双抗体法双抗体法沉淀法沉淀法葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白蛋白固相法固相法AbAb聚乙二醇聚乙二醇AgAbAgAb沉淀。沉淀。双抗体法双
13、抗体法葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白蛋白。活性炭吸附法活性炭吸附法活性炭能吸附小分子的游离抗原，离心活性炭能吸附小分子的游离抗原，离心后的复合物留在上清液中，游离抗原沉在后的复合物留在上清液中，游离抗原沉在沉淀中。沉淀中。特点：易于解离，须严格掌握时间和温特点：易于解离，须严格掌握时间和温度。度。葡聚糖包被活性炭（葡聚糖包被活性炭（DCCDCC）-能增加吸能增加吸附效果和减少解离。附效果和减少解离。固相法固相法抗体吸附固体支持物或反映试管上抗体吸附固体支持物或反映试管上常用的固体支持物：常用的固体支持物：塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙）塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙）纤维素纤维素凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂
14、糖、聚丙烯酰胺）凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）多孔玻璃微球多孔玻璃微球部分游离抗原未被洗净部分游离抗原未被洗净-沉沉淀法和固相法淀法和固相法分离剂质量差或量不足分离剂质量差或量不足分离效果差的原因分离效果差的原因RIARIA质量控制质量控制目的：目的：保证分析误差控制在可接受的保证分析误差控制在可接受的 范围内范围内分类分类实验室内部质控实验室内部质控 实验室间质控实验室间质控系统误差 表现为结果呈倾向性偏高或偏低。常见因素方法误差：如标准品稀释不正确，分离效果不好等仪器和试剂：仪器状态、量器、试剂纯度等操作误差：操作习惯、加错样品等。通过努力系统误差可以消除。随机误差 表现为某一管或
15、某一部分样本的结果误差随机的、偶然的，小误差的概率大。常由操作者操作不当造成。误差的来源误差的来源：质量控制的指标质量控制的指标1 1、稳定性、稳定性2 2、精密度、精密度3 3、灵敏度、灵敏度4 4、准确度、准确度1 1、稳定性：、稳定性：指RIA实验批间的重复性。常用指标：常用指标：零标准管结合率零标准管结合率（B0%）:没有待测物时，标记抗原与抗体之间能产生的最大结合率（一般要求在30-50%）非特异性结合率非特异性结合率（NSB%）：没有结合剂（抗体）的存在下，标记配体（抗原）被分离试剂结合造成的结合率，（一般要求99%ED25、ED50、ED75 即标准曲线在25%、50%、75%时
16、横坐标上对应的抗原浓度值。反映标准曲线的稳定性。2 2、精密度：、精密度：是对某一样品多次检测所得结果的符合程度。即复管的重复性。是最重要的质量参数。3 3、灵敏度：、灵敏度：方法的最小可测值。计算方法是累计多批（一般10次）测量结果，计算出零标准管的结合率为x2SD时对应的剂量值。4 4、准确度：、准确度：是指测量值与真值的接近程度，评价方法：回收率：回收率：是反应测定值偏差的质控指标。对照管加入待测样品，回收管加入待测样品和已知量的标准品，两者实测结果相减即为外加标准品的实测含量。要求：接近100%，且变异小。质控样品：质控样品：含有一种或几种测定物，其量值是经过标定的靶值，用来比较和评价
17、测定系统的偏离和重复性的实验用血清。一般有高中低三种类型，衡量该批分析结果的准确度。健全性：健全性：用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。用样本稀释曲线与标准曲线的平行度来判断。准确性和精密性如同打靶精确度好偏差小精确度好偏差小偏差小精确度差偏差小精确度差精确度好偏差大精确度好偏差大偏差大精确度差偏差大精确度差精确性问题是随机误差问题，而偏差是系统误差问题精确性问题是随机误差问题，而偏差是系统误差问题RIARIA手工操作的质控难题手工操作的质控难题数十、百次加样的数十、百次加样的“移液误差移液误差”由分离技术带来的由分离技术带来的“错分误差错分误差”由样本量大所致的由样本量大所致的“漂移
18、误差漂移误差”测定的精度测定的精度“取决取决”于工作人员的状态于工作人员的状态RIA的特点：的特点：灵敏度高灵敏度高 示踪高灵敏可达10-910-12g 特异性强特异性强 免疫学反应，抗体为结合试剂特异结合的三维结合的位点 精确度好精确度好 方法的稳定性好稳定性好 应用广泛应用广泛 缺陷缺陷-造成放射免疫难以进行造成放射免疫难以进行全自动全自动化分析化分析RIARIA面临挑战面临挑战半衰期短（受半衰期短（受125125I TI T1/21/2的限制），药盒使用寿命的限制），药盒使用寿命一般不超过一般不超过2 2个月；个月；由于标记物的不断变化，带来药盒批间、批内较大由于标记物的不断变化，带来药
19、盒批间、批内较大的差异，标准曲线必须同批有效；的差异，标准曲线必须同批有效；为了达到有效的质量控制，样本须做复管测定；为了达到有效的质量控制，样本须做复管测定；放射性测量有统计涨落，依靠时间累计，至少计数放射性测量有统计涨落，依靠时间累计，至少计数1min1min；反应时间过长（数小时甚至过夜）。反应时间过长（数小时甚至过夜）。真正使放免面临挑战的是20世纪90年代兴起的全自动化标记免疫分析全自动化标记免疫分析的问世。这种方法、仪器、试剂三位一体的特定分析系统有效地解决了大规模临床大规模临床样本检测样本检测的稳定、高效、快速、自动化问题。是医学超微量分析的一次战略性革命。一一.概述概述二二.放
20、射免疫分析（放射免疫分析（RIA）基本试剂 基本原理 操作过程 分离技术 质量控制 四四.非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）三免疫放射分析（三免疫放射分析（IRMAIRMA）免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）IRMA定义定义是以125I标记抗体，用过量的标记抗体与待测抗原形成复合物，分离除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。Ag*Ab Ag*AbIRMAIRMA基本原理基本原理与与RIARIA的不同：的不同：放射性标记的是抗体而不是抗原,且抗原与过量的标记抗体结合反应,故反应是非竞争性的
21、全量反应。IRMA与RIA的工作原理的主要区别项目项目RIARIAIRMAIRMAu反应机制反应机制竞争性反应竞争性反应非竞争性全量反非竞争性全量反应灵敏度提高应灵敏度提高（10-10010-100倍）倍）u主要反应试剂主要反应试剂 三种三种 标记抗原标记抗原二种二种 标记抗体标记抗体u分离方法分离方法抗原只需一个抗抗原只需一个抗原决定簇原决定簇 一般需单抗作分一般需单抗作分离剂，抗原需两离剂，抗原需两个或两个以上决个或两个以上决定簇定簇u待测抗原复合待测抗原复合物放射性物放射性 与待测抗原呈负与待测抗原呈负相关相关与待测抗原呈正与待测抗原呈正相关相关u非特异性结合非特异性结合 主要影响高剂量
22、主要影响高剂量反应反应主要影响低剂量主要影响低剂量反应反应结合率（结合率（%）Ag剂量剂量RIAIRMAIRMA和和RIARIA曲线形态比较曲线形态比较结合率（结合率（%）Ag剂量剂量IRMAIRMAIRMA法分类法分类双抗体夹心法：双抗体夹心法：采用了固相抗体法标记第三抗体法：标记第三抗体法：第三抗体即夹心法中的标记抗体的抗体（双抗）标记三抗作为通用示踪剂，可用于多种待测抗原的分析。IRMAIRMA局限性局限性至少需要两个抗体；至少需要两个抗体；对缓冲液对缓冲液PHPH及离子强度的要求较为严及离子强度的要求较为严格；格；待测抗原的量太大时，易出现待测抗原的量太大时，易出现“倒钩倒钩”现象。现
23、象。一一.概述概述二二.放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）基本试剂 基本原理 操作过程 分离技术 质量控制 酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）三免疫放射分析（三免疫放射分析（IRMAIRMA）四四.非放射性标记免疫分析技非放射性标记免疫分析技术术 非放射性标记免疫分析技术分类非放射性标记免疫分析技术分类酶标免疫分析酶标免疫分析（酶免疫发光、酶免疫荧光、酶免疫发光）发光免疫分析发光免疫分析（化学发光、酶放大发光、电化学发光）荧光免疫分析（荧光免疫分析（荧光偏振免疫、时间分辨荧光免疫分析）颗粒计数免疫分析颗粒计数免疫分析一、酶免疫分析技术一、酶免疫
24、分析技术定义：定义：酶分子代替放射性核素标记抗酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子，利用酶促作用使底物反原或抗体分子，利用酶促作用使底物反应，利用酶使底物显色的作用而使酶的应，利用酶使底物显色的作用而使酶的作用得到放大，进行竞争性或非竞争性作用得到放大，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。免疫分析的技术。最常用：最常用：酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附分析法（ELISAELISA）常用的酶：常用的酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP(HRP）常用的底物：常用的底物：四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMB)TMB)，反应后显黄色，反应后显黄色 氨基水杨酸（氨基水杨酸（5-AS5-AS），），棕
25、色棕色 常用方法：常用方法：固相测定法固相测定法测定方式：测定方式：分光光度计分光光度计化学发光酶免疫测定（化学发光酶免疫测定（CLIEACLIEA）：）：不同之不同之 处是酶反应所用底物为发光剂。处是酶反应所用底物为发光剂。用能产生化学发光的化合物代替放用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物射性标记物发光化合物：发光化合物：异鲁米那 甲基氮蒽缺点：发光时间缺点：发光时间二、化学发光免疫分析二、化学发光免疫分析（CLIA）化学发光酶免疫分析（化学发光酶免疫分析（CLEIACLEIA）标记物：碱性磷酸酶的抗体 底 物：金刚烷 优 点：可靠性好电化学发光免疫（化学发光免疫（ECLIECLI）标记
26、物：三联吡啶钌每小时能作每小时能作180180个不同检测（每个不同检测（每2020秒做一个试秒做一个试验）验）1515分钟有第一个结果；分钟有第一个结果；急诊样本可随时插入而无需中断正进行的分急诊样本可随时插入而无需中断正进行的分析；析；全自动随机取样，可同时作全自动随机取样，可同时作1313个不同项目，个不同项目，兼具有批量分析能力；兼具有批量分析能力；试剂稳定期长，有自动重检功能、自动稀释试剂稳定期长，有自动重检功能、自动稀释重检功能；重检功能；两点定标和再定标，标准曲线储存、连续使两点定标和再定标，标准曲线储存、连续使用用4 4周以上，减少标准品消耗；周以上，减少标准品消耗；是目前测定最
27、快的。是目前测定最快的。三、时间分辨荧光免疫分析技术三、时间分辨荧光免疫分析技术（TR-FIA）镧系元素铕（Eu）铽（Tb）钐（Sm）镝（Dy）并非荧光素，但由于特殊的理化性质，在离子价态时受到紫外光或激光的激发后会以荧光形式发射持续一定时间、一定光峰光谱，而其他非特异荧光寿命短，利用时间分辨可排除背景荧光的干扰。常用方法：常用方法：双位点夹心法、BAS增强双位点夹心法、相抗原竞争法、固相抗体竞争法优点：优点：提高了灵敏度，不损害样品而可以重复测量或做其他测量。高度自动化。高度自动化。待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析10-1210 -910 -610 -310 0pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/mL免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins
