1、Impeding Macrophage Entry into Hypoxic Tumor Areas by Sema3A/Nrp1 Signaling Blockade Inhibits Angiogenesis and Restores Antitumor Immunity（通过阻断Sema3A/Nrp1信号通路抑制巨噬细胞进入肿瘤低氧区以抗血管生成并恢复抗肿瘤免疫）Andrea Casazza,Damya Laoui,Mathias Wenes,et al.Cancer Cell 24,695709,December 9,20132023-2-61文献阅读2023-2-62文献阅读文献阅读
2、研究背景 肿瘤相关巨噬细胞(TAM）：浸润至肿瘤组织中的巨噬细胞，通常与肿瘤的不良预后相关。大多数情况下，TAM，预后越差；少数情况，则相反。TAM具有促肿瘤（M2型）和抗肿瘤（M1型）的双重作用。M2促血管生成、抑制免疫反应；M1促炎症反应，杀伤肿瘤细胞。功能相反的TAM占据肿瘤组织的不同位置。低氧区TAM促肿瘤，常氧区TAM抗肿瘤 巨噬细胞受到微环境中特殊信号的“训导”？2023-2-63文献阅读文献阅读研究背景 Nrp1是Sema3A的受体，已有研究已有研究表明阻断Nrp1可抑制肿瘤生长，通过抑制多种癌细胞的血管生成及增殖。前期研究前期研究表明，Nrp1可作为促血管生成的巨噬细胞（M2）
3、标记物。2023-2-64文献阅读研究思路2023-2-6文献阅读5Nrp1作为Sema3A受体Nrp1作为促血管生成巨噬细胞标记物，低氧区的巨噬细胞促血管生成通过通过阻断阻断Sema3A/Nrp1Sema3A/Nrp1信号信号是否可以是否可以抑制巨噬细胞进入抑制巨噬细胞进入肿瘤肿瘤低氧区低氧区，从而，从而起到起到抗抗血管生成并恢复抗血管生成并恢复抗肿瘤肿瘤免疫的作用？免疫的作用？阻断Nrp1，抑制血管生成，抗肿瘤生长1.巨噬细胞中NRP1缺失抑制肿瘤生长2.NRP1缺失阻止巨噬细胞进入低氧区8.Sema3A限制了TAM在肿瘤组织中位置5.低氧区巨噬细胞的NRP1的转录受到抑制7.NRP1表达
4、与否Sema3A活化相反信号途径3.NRP1缺失导致TAM再分布抑制肿瘤生长6.低氧调节NRP1限制巨噬细胞对Sema3A的应答4.NRP1缺失导致TAM再分布恢复抗肿瘤免疫/减少血管生成阻断Sema3A/Nrp1信号抑制巨噬细胞进入低氧区抗肿瘤的作用机制研究内容2023-2-66文献阅读表型表型机制机制研究结果：1.巨噬细胞中NRP1的缺失抑制肿瘤生长建立LysM-Cre;Nrp1L/L转基因小鼠（简称L/L），特征：TAM中Nrp1的表达下降92%，单核细胞中Nrp1下降81%，TAN或DC中Nrp1下降60%。对照组LysM-Cre;Nrp1+/+简称野生型WT，基本正常。2023-2-
5、67文献阅读文献阅读研究结果：1.巨噬细胞中NRP1的缺失抑制肿瘤生长2023-2-68文献阅读研究结果：1.巨噬细胞中NRP1的缺失抑制肿瘤生长建立iCSF1R-Cre;Nrp1L/L转基因小鼠，特异性删失TAM中Nrp1，其他骨髓细胞中Nrp1的表达不受影响。对照组iCSF1R-Cre;Nrp1+/+简称野生型WT，基本正常。2023-2-69文献阅读研究结果：2.巨噬细胞中NRP1的缺失阻止其进入低氧区对比WT组，Nrp1缺失组（即L/L），TAM总的数量增加；且低氧区的面积扩大2023-2-610文献阅读研究结果：2.巨噬细胞中NRP1的缺失阻止其进入低氧区对比WT组，Nrp1缺失组（
6、即L/L），TAM主要集中在常氧区，而在低氧区中的数量减少在iCSF1R-Cre;Nrp1L/L转基因小鼠观察到相同的结果2023-2-611文献阅读文献阅读研究结果：3.NRP1缺失导致TAM再分布抑制原位和自发性肿瘤生长建立两种原位肿瘤模型（LLC原位肺癌模型、Panc02原位胰腺癌模型）和PyMT自发性乳腺癌模型，同样证实Nrp1缺失可以导致TAM再分布，并抑制肿瘤生长，说明Nrp1缺失效应与肿瘤组织来源无关2023-2-612文献阅读研究结果：3.NRP1缺失导致TAM再分布抑制原位和自发性肿瘤生长2023-2-613文献阅读研究结果：3.NRP1缺失导致TAM再分布抑制原位和自发性肿
7、瘤生长2023-2-614文献阅读文献阅读研究结果：4.NRP1缺失导致TAM再分布恢复免疫功能及减少血管生成前面观察到LysM-Cre;Nrp1L/L转基因小鼠TAM不能进入肿瘤低氧区，那么这将对TAM功能表型有何影响？方法：将分离自转基因小鼠的TAM与EC共培养2023-2-615文献阅读研究结果：4.NRP1缺失导致TAM再分布恢复免疫功能及减少血管生成来自L/L组TAM促EC迁移和毛细血管网形成减少释放更多NO、对肿瘤细胞更具细胞毒性，促进T细胞增殖2023-2-616文献阅读文献阅读研究结果：4.NRP1缺失导致TAM再分布恢复免疫功能及减少血管生成促进CD8+CTL增殖2023-2
8、-617文献阅读文献阅读研究结果：4.NRP1缺失导致TAM再分布恢复免疫功能及减少血管生成Th1因子增多2023-2-618文献阅读文献阅读研究结果：4.NRP1缺失导致TAM再分布恢复免疫功能及减少血管生成呈现M1型增多、M2型减少（M1表达NOS2/Cxcl9/Il-12/Cxcl10，M2表达Arg1/Ym1/Il-10/Ccl22）2023-2-619文献阅读研究结果：5.缺氧巨噬细胞的NRP1的转录受到抑制明确Nrp1的效应之后，进一步研究了Nrp1调控TAM在缺氧区域的定位机制2023-2-620文献阅读研究结果：5.缺氧巨噬细胞的NRP1的转录受到抑制进一步探索缺氧抑制巨噬细胞
9、中Nrp1表达的分子机制，HIF-2可以抑制Nrp1表达过表达NF-kB的亚基p50/p65，在Hif2a-KO或Ikbkb-KO巨噬细胞中将恢复Nrp1转录抑制2023-2-623文献阅读研究结果：5.缺氧巨噬细胞的NRP1的转录受到抑制 HIF-2在巨噬细胞中的低氧稳定作用解开了经由IKK介导的NF-kB经典途径。因此，释放活化的p50/p65异质二聚体可以阻断Nrp1的表达。2023-2-624文献阅读研究结果：5.缺氧巨噬细胞的NRP1的转录受到抑制与常氧区的BMDM或者TAM比较，缺氧区中的缺氧应答基因Flt1（编码VEGFR1）上调，而Nrp1的缺失并不影响这种调节作用2023-2
10、-621文献阅读研究结果：5.缺氧巨噬细胞的NRP1的转录受到抑制肿瘤的缺氧区域，Sema3a/Vegfa的表达都上调了（Fig F/G）。2023-2-622文献阅读研究结果：6.受缺氧调节的Nrp1限定了巨噬细胞对Sema3A的应答Sema3A趋化巨噬细胞必需Nrp1，但VEGF164不是。VEGF120(不能有效绑定Nrp1)与VEGF164一样具有趋化WT和Nrp1-KO BMDMs的作用(FA)。Nrp1的缺失导致对Sema3A、VEGF164对巨噬细胞趋化能力减弱，而VEGF120的能力没有变化。2023-2-625文献阅读研究结果：6.受缺氧调节的Nrp1限定了巨噬细胞对Sema
11、3A的应答联合应用VEGF164/Sema3A比单用VEGF164效应低，NRP1缺失时，Sema3A拮抗VEGF的趋化效应。2023-2-626文献阅读研究结果：6.受缺氧调节的Nrp1限定了巨噬细胞对Sema3A的应答通过细胞的绑定实验证实，显示Sema3A可以非常明显的绑定在Nrp1-KO细胞上。因此，Sema3A能与Nrp1-KO巨噬细胞发生相互作用。2023-2-627文献阅读研究结果：6.受缺氧调节的Nrp1限定了巨噬细胞对Sema3A的应答CCL21具有将巨噬细胞从缺氧区域吸引出来。Sema3A降低Nrp1-KO或者缺氧WT小鼠中巨噬细胞对CCL21的诱使活动。2023-2-62
12、8文献阅读文献阅读研究结果：7.根据Nrp1表达与否Sema3A活化相反的信号Sema3A诱导VEGFR1 Tyr1213磷酸化。Nrp1缺失的巨噬细胞完全废除Sema3A依赖的VEGFR1的活化，导致对VEGF的应答没有明显影响。2023-2-629文献阅读研究结果：7.根据Nrp1表达与否Sema3A活化相反的信号敲低VEGFR1将抑制Sema3A或者VEGF164对WT和Nrp-KO巨噬细胞的趋化活动，提示Nrp1需要VEGFR1去转化Sema3A介导的吸引性信号。2023-2-630文献阅读研究结果：7.根据Nrp1表达与否Sema3A活化相反的信号沉默PlexinA1或者A4，可停止
13、Sema3A介导的VEGFR1磷酸化和迁移能力，与Nrp1基因删失效果一致。2023-2-631文献阅读研究结果：7.根据Nrp1表达与否Sema3A活化相反的信号在Nrp1存在的情况下，Sema3A/PlexinA1/A4/信号轴通过VEGFR1激活介导吸引性信号，而在Nrp1缺失的情况下将变为停止信号。2023-2-632文献阅读文献阅读研究结果：8.Sema3A限制TAM在肿瘤组织中的位置建立Nrp1/Sema-基因敲入小鼠，特征：Sema3A-Nrp1结合位点破坏，而与VEGF164的结合不受影响。Nrp1/Sema-巨噬细胞不能朝向Sema3A迁移，而对VEGF164或者VEGF12
14、0都能正常迁移。2023-2-633文献阅读研究结果：8.Sema3A限制TAM在肿瘤组织中的位置Nrp1/Sema-基因敲入小鼠，同样显示肿瘤生长抑制及血管生成减少，并伴有缺氧区的扩大和TAM总数的增加2023-2-634文献阅读研究结果：8.Sema3A限制TAM在肿瘤组织中的位置同样，Nrp1/Sema-巨噬细胞不能进入肿瘤缺氧区域，与 LysM-Cre;Nrp1L/L小鼠中巨噬细胞表型类似。2023-2-635文献阅读研究结果：8.Sema3A限制TAM在肿瘤组织中的位置将沉默Sema3A的LLC细胞株（LLC-Sh3A）注入WT和LysM-Cre;Nrp1L/L小鼠中，观察到相同的结
15、果。2023-2-636文献阅读文献阅读结论 阐释了TAM从血管周围/常氧区进入无血管/低氧区，并定位于肿瘤低氧区域的作用机制：首先依靠Sema3A介导的Nrp1/PlexinA1/A4/VEGFR1信号途径，吸引TAM进入低氧区，随后受低氧调节Nrp1表达下调，再通过Sema3A介导的Nrp1非依赖的PlexinA1/A4停止信号，限制TAM于低氧区域，从而使TAM呈现促肿瘤的表型。TAM的异质性取决于它们的定位区域，而位置的确定与Sema3A/Nrp1信号通路密切相关。2023-2-637文献阅读2023-2-638文献阅读文献阅读研究意义 解释TAM所处位置与肿瘤患者生存期相关，即定位于肿瘤缺氧区域的巨噬细胞，预后不良；而位于血管周围、常氧区域，则预后较好，对临床预后判断具有一定的价值 为临床抗肿瘤药物的研发提供了新的靶点（因为选择性的阻断Sema3A与Nrp1结合，将阻止血管形成抑制肿瘤生长）并且该靶点无组织特异性，不同于目前的靶向药物，具有重大价值，但尚需临床验证。2023-2-639文献阅读文献阅读2023-2-6文献阅读40
