1、ContentsContents第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变与诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程几个概念几个概念u遗传（Heredity,Inheritance）一切生物体最基本的属性之一生物的亲代传递给子代一套遗传信息的特性。即子代与亲代在形态、生理等方面的相似性u遗传型（基因型遗传型（基因型GenotypeGenotype）生物体所携带的全部遗传因子或基因的总称遗传型代表了可能性，在环境条件下的作用为表型u表现型（现实型表现型（现实型PhenotypePhenotype）具有一定遗传型的个体在特定的外界环境中，通过生长发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和u
2、变异（变异（Mutation）生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。发生物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。发生几率极低，性状变化幅度大，新性状稳定可遗传。几率极低，性状变化幅度大，新性状稳定可遗传。u饰变（饰变（Modification）一种不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、转一种不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、转译水平上的表型变化。译水平上的表型变化。饰变的特点：发生几率高；性状变化幅度小；不饰变的特点：发生几率高；性状变化幅度小；不遗传。同一遗传型在不同外界条件下所呈现的表遗传。同一遗传型在不同外
3、界条件下所呈现的表现型的差异。现型的差异。突变与饰变的实例突变与饰变的实例Serratia粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌Serratia marcescens产生色素与温度有关产生色素与温度有关微生物作为模式生物生物学特性微生物作为模式生物生物学特性 物质与代谢类型的多样性物质与代谢类型的多样性 个体体制极其简单个体体制极其简单 营养体一般都是单倍体营养体一般都是单倍体 菌落形态的可见性和多样性菌落形态的可见性和多样性 环境条件作用的直接性和均一性环境条件作用的直接性和均一性 容易形成营养缺陷型菌株容易形成营养缺陷型菌株 相应的病毒相应的病毒 存在于进化过程中存在于进化过程中 原始有性生殖方式原始有
4、性生殖方式第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、遗传物质化学本质的确证一、遗传物质化学本质的确证u1928年年,F.Griffith;1944年年O.T.Avery肺炎链球菌肺炎链球菌(strptococcus pneumoniae)转化实验转化实验.u1952年，年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌体感染实验的噬菌体感染实验u1956年，年，H.Fraenkel-Conrat的植物病毒重建实验的植物病毒重建实验1、肺炎双球菌转化实验uS.Pneumoniae肺炎双球菌的特性肺炎双球菌的特性l光滑型（光滑型（Smooth,S型）型）荚膜，人肺炎、鼠败血症荚膜，人肺炎、
5、鼠败血症l粗糙型（粗糙型（Rough,R型）型）无荚膜，无毒无荚膜，无毒u动物实验动物实验u细菌培养实验细菌培养实验uS型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验能从上述实验中得到什么结论？u在加热杀死的S型细菌细胞中可能存在一种具有遗传转化能力的物质，能通过某种方式进入R细胞，并使R型细胞获得表达S型荚膜性状的遗传特性？u到底是什么物质呢？DNA？蛋白质 荚膜多糖 RNA热死热死S S菌菌培培养养活活R R菌菌培培养养热死热死S S菌菌+活活R R菌菌培培养养细菌培养实验细菌培养实验无细胞抽提液实验无细胞抽提液实验转化因子本质的阐明2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验u用35S和32P去分别
6、标记大肠杆菌，然后再用T2噬菌体感染，即得到分别含有32P-DNA核心的噬菌体或含35S-蛋白质外壳的噬菌体；u把标记噬菌体与其宿主大肠杆菌混合，经短时间（如10min）保温后，使T2完成吸附和侵入过程；u在组织捣碎器中剧烈搅拌，以使吸附在菌体外表的T2蛋白外壳脱离细胞并均匀分布u进行离心沉淀，再分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。3 3、植物病毒重建实验、植物病毒重建实验uTobacco mosaic virus TMV,H.Fraenkel-Conrat in 1956 烟草花叶病毒TMV 霍氏车前草花叶病毒HRV 苯酚溶液中震荡分离蛋白质外壳和RNA核心植物病毒重建实验植物病毒重建实验
7、结论：核酸是负荷遗传信息的物质基础结论：核酸是负荷遗传信息的物质基础二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式u遗传物质的七个水平遗传物质的七个水平 细胞水平细胞水平 细胞核水平细胞核水平 染色体水平染色体水平 核酸水平核酸水平 密码子水平密码子水平 核苷酸水平核苷酸水平u生物体生物体DNA大部分或几乎存在于细胞核（真核）大部分或几乎存在于细胞核（真核）或核质体（原核）中或核质体（原核）中u不同微生物细胞，细胞核数目不同不同微生物细胞，细胞核数目不同l单核单核S.cerevisiae、A.niger、孢子孢子l双核双核杆菌细胞存在两个核区（球菌一般一个）杆菌细胞存
8、在两个核区（球菌一般一个）l多核多核粗糙脉胞菌粗糙脉胞菌、米曲霉米曲霉、藻状菌、放线菌藻状菌、放线菌1 1、细胞水平、细胞水平2、细胞核水平、细胞核水平u基因组、核基因组或核染色体组基因组、核基因组或核染色体组l真核生物真核生物核膜包裹，核膜包裹，DNA与组蛋白结合形成染色体与组蛋白结合形成染色体l原核生物原核生物无核包裹，无核包裹，DNA裸露，环状双链裸露，环状双链u广义质粒广义质粒核外染色体核外染色体l真核生物质粒真核生物质粒 细胞质基因：线粒体、叶绿体细胞质基因：线粒体、叶绿体 共生生物：共生生物：Kappa Particle 2um质粒（酵母菌质粒位于核内，不与核染质粒（酵母菌质粒位于
9、核内，不与核染色体组整合）色体组整合）l原核生物质粒：原核生物质粒：F因子、因子、R因子、因子、Col 质粒等质粒等3 3、染色体水平、染色体水平u染色体数目染色体数目 人：人：23；水稻：；水稻：12；大肠杆菌：；大肠杆菌：1；酿酒酵母：；酿酒酵母：1617；枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：1u染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数 真核生物：多条染色体，单倍体、双倍体真核生物：多条染色体，单倍体、双倍体 原核生物：一条裸露的原核生物：一条裸露的DNA构成的环状染色体构成的环状染色体 单倍体单倍体Heploid 细胞仅含有一套染色体的个体。如多数微生物、高等
10、动细胞仅含有一套染色体的个体。如多数微生物、高等动植物的生殖细胞植物的生殖细胞 双倍体：细胞含有两套功能相同的染色体的个数。如多双倍体：细胞含有两套功能相同的染色体的个数。如多数高等动物、植物体细胞、啤酒酵母营养细胞、合子等数高等动物、植物体细胞、啤酒酵母营养细胞、合子等4 4、核酸水平、核酸水平u核酸种类核酸种类 多数生物遗传物质为多数生物遗传物质为DNA，少数病毒为，少数病毒为RNA 原核原核DNA裸露裸露 真核真核DNA被包裹，与组蛋白结合在一起被包裹，与组蛋白结合在一起u核酸结构核酸结构 DNA双链、单链；双链、单链；RNA单链、双链单链、双链 环状、线状、超螺旋环状、线状、超螺旋uD
11、NA长度：长度：基因组的大小，单位：基因组的大小，单位：bp、kb、mbu微生物基因组测序微生物基因组测序5 5、基因水平、基因水平u基因基因生物体内一切具有自主复制能力的遗传功能单生物体内一切具有自主复制能力的遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段核苷酸序列的核酸片段u原核生物的基因调控原核生物的基因调控基因调空表达系统操纵子调节基因 启动基因操纵基因结构基因操纵子Operonu结构基因结构基因决定某一多胎链结构的决定某一多胎链结构的DNA摸板摸板u操纵基因操纵基因位于结构基因和启动基因之间的一段核苷酸位于结构基因和启动
12、基因之间的一段核苷酸序列序列u启动基因启动基因一种依赖于一种依赖于DNA和和RNA聚合酶所识别的核苷聚合酶所识别的核苷酸序列酸序列真核生物的基因组结构u一般无操纵子结构u存在大量不编码序列和重复序列u转录和转译在细胞中有空间间隔u基因被许多无编码功能的内含子Intron阻隔，使编码序列变成不连续的外显子基因及其表达产物的规范化表示u基因名称：lacZu基因表达产物：三个大写字母、或1个大写2个小写字母u抗性基因：strRu遗传密码是指基因遗传密码是指基因DNA链上决定各具体氨基酸的核链上决定各具体氨基酸的核苷酸的特定排列顺序苷酸的特定排列顺序u密码子密码子Condon：遗传密码的：遗传密码的信
13、息单位信息单位每个密码子由链上三个核苷酸顺序决定，常以每个密码子由链上三个核苷酸顺序决定，常以mRNA上三个核苷酸顺序上三个核苷酸顺序表示三联密码子表示三联密码子l四个核苷酸有四个核苷酸有64种组合种组合l同一氨基酸由多个密码子编码同一氨基酸由多个密码子编码l无义密码子：无义密码子：UAA、UAG、UGA6 6、密码子水平、密码子水平7 7、碱基水平（核苷酸水平）、碱基水平（核苷酸水平）u最低突变单位或交换单位最低突变单位或交换单位uDNA链中有链中有A（腺嘌呤）、（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、（胸腺嘧啶）、G（鸟嘌呤）（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）四种碱基（胞嘧啶）四种碱基u几个数据几个数据 每个碱
14、基对的平均分子量每个碱基对的平均分子量650 1*106的的dsDNA约为约为1.5kb，或，或0.5um 3nm碱基重量约为碱基重量约为1ug 多数细菌的基因组在多数细菌的基因组在19Mb（二）原核生物的质粒（二）原核生物的质粒u质粒的定义和特点质粒的定义和特点u质粒在基因工程中的应用质粒在基因工程中的应用u质粒的分离与鉴定质粒的分离与鉴定u质粒的种类质粒的种类u典型的质粒简介典型的质粒简介质质 粒粒 的的 定定 义义u典型质粒典型质粒凡是游离于原核生物基因组以外，具有独立复制凡是游离于原核生物基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的能力的小型共价闭合环状的dsDNA(cccDNA)
15、u质粒的结构质粒的结构 麻花状的超螺旋结构麻花状的超螺旋结构1.5300kb，Mw106108，相当于约，相当于约1%基因组基因组 线状质粒：天蓝色链霉素、赫氏蜱疏螺旋体线状质粒：天蓝色链霉素、赫氏蜱疏螺旋体质质 粒粒 的的 特特 点点u质粒的功能：质粒的功能：非必需的特殊功能非必需的特殊功能接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶和降解环境毒接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶和降解环境毒物、基因重组物、基因重组u质粒的复制：质粒的复制：独立存在于细胞内的复制子独立存在于细胞内的复制子松弛型复制控制松弛型复制控制：质粒复制与核染色体复制不同步，：质粒复制与核染色体复制不同步，一般只含一般只含1-2个质粒
16、个质粒严紧型复制控制严紧型复制控制：质粒复制与核染色体复制不同步，：质粒复制与核染色体复制不同步，一般可含一般可含10-15个个u质粒消除：质粒消除：吖啶类染料、丝裂霉素吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福、紫外线、利福平、重金属离子、高温平、重金属离子、高温u可整和性质粒可以与核染色体发生整和与脱离，如F因子，这种质粒称附加体附加体整和：指质粒或温和噬菌体、病毒、转化因子等小型非染色体DNA插入核基因组等大型DNA分子中的现象u重组性质粒与质粒之间、质粒与核染色体之间的基因重组质质 粒粒 的的 特特 点点质粒在基因工程中的应用u质粒用于基因工程操作的优点质粒用于基因工程操作的优点 体积小体积
17、小 环状环状 独立复制起始点独立复制起始点 拷贝数多拷贝数多 选择性标记：抗性基因选择性标记：抗性基因u质粒的应用质粒的应用 克隆载体：能够完成外源克隆载体：能够完成外源DNA片段复制的片段复制的DNA分子分子质粒的分离与鉴定质粒的分离与鉴定u质粒分离的步骤质粒分离的步骤 细胞培养细胞培养 细胞裂解细胞裂解 蛋白质和蛋白质和RNA的去除的去除 质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA分离分离u质粒的鉴定质粒的鉴定 电镜电镜 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 密度梯度离心密度梯度离心 质粒的限制性酶切图谱质粒的限制性酶切图谱质粒的种类质粒的种类1.接合性质粒2.抗药
18、性质粒3.产细菌素和抗生素质粒4.特定生理功能质粒5.产毒质粒典型质粒典型质粒uF质粒质粒uR质粒质粒uCol质粒质粒uTi质粒质粒uRi质粒质粒uMega质粒质粒u降解性质粒降解性质粒F质粒质粒 F PlasmiduF因子因子致育因子致育因子Fertility Factor性因子性因子Sex FactoruE.Coli决定性别并具有转移能力的质粒决定性别并具有转移能力的质粒u存在存在F质粒的其他微生物质粒的其他微生物 Pseudomonas（假单胞菌属）（假单胞菌属）Haemophilus（嗜血杆菌属）（嗜血杆菌属）Neisseria（奈瑟氏菌属）（奈瑟氏菌属）Streptococcus（链
19、球菌属）（链球菌属）u什么是基因突变（突变）？变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质（DNA或RNA）的变化，可自发或诱导产生。狭义突变：基因突变（点突变）广义突变：基因突变和染色体畸变u突变率：一般很低10-610-9u野生型菌株野生型菌株Wild type strian从自然界中分离到的菌株u突变株突变株Mutant野生型菌株经突变以后形成的带有新性状的菌株一、基因突变一、基因突变u选择性基因突变选择性基因突变凡是能用选择性培养基（选择条件）快速选择凡是能用选择性培养基（选择条件）快速选择出来的突变株出来的突变株选择性突变株选择性突变株 营养缺陷型营养缺陷型 抗性突变型抗性突变型 条
20、件致死突变型条件致死突变型u非选择性基因突变非选择性基因突变 形态变态型形态变态型 抗原突变型抗原突变型 产量突变型产量突变型（一）基 因 突 变 类 型u某野生型菌株由于发生基因突变引起某酶合成能力丧失，从而丧失合成一种或几种生长因子能力的突变型，无法再在基本培养基（MM）上正常生长反之，须在加入相应生长因子的基本培养基上才能正常生长的变异类型u营养缺陷型突变菌株的应用 遗传学 分子生物学 遗传工程 微生物育种1、营养缺陷型Auxotroph2 2、抗性突变型、抗性突变型Resistant MutantResistant Mutantu指野生型菌株由于发生指野生型菌株由于发生基因突变基因突变
21、而产生了对某化而产生了对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型学药物或致死物理因子的抗性变异类型u化学药物或致死因子化学药物或致死因子抗生素、紫外线抗生素、紫外线u抗性突变性突变菌株的应用抗性突变性突变菌株的应用 遗传学遗传学 分子生物学分子生物学 遗传工程遗传工程 微生物育种微生物育种3、条件致死突变型、条件致死突变型uConditional lethal mutant某菌株或病毒经基因突变后，在某条件下可正常生长、某菌株或病毒经基因突变后，在某条件下可正常生长、繁殖，表现其正常的表型，在另一条件下无法生长、繁殖，表现其正常的表型，在另一条件下无法生长、繁殖的突变类型繁殖的突变类型u实例：温
22、度敏感突变株实例：温度敏感突变株Temperature sensitive mutant,Ts Mutant E.Coli：37度下正常生长、度下正常生长、42度不能生长度不能生长 T4噬菌体：噬菌体：25度下具有感染力，度下具有感染力，37度无感染力度无感染力导致导致Ts 突变的原因突变的原因 蛋白质的结构与功能发生改变蛋白质的结构与功能发生改变4、形态突变型、形态突变型uMorphological MutantMorphological Mutant由于突变引起由于突变引起个体或菌落形态个体或菌落形态的非选择性变异的非选择性变异u实例：微生物的菌落和个体形态包括那些？实例：微生物的菌落和个
23、体形态包括那些？u芽孢、鞭毛、荚膜、菌落大小粗糙（光滑）、颜芽孢、鞭毛、荚膜、菌落大小粗糙（光滑）、颜色、霉菌放线菌孢子的有无及颜色、噬菌斑大小或色、霉菌放线菌孢子的有无及颜色、噬菌斑大小或清晰度清晰度5 5、抗原突变型、抗原突变型u基因突变引起抗原结构（细胞或细胞表面成分）发生变异的突变型，一般属于非选择性突变u实例 细胞壁缺陷变异：L型细菌 荚膜成分变异 鞭毛成分变异6、产量突变型、产量突变型u通过基因突变而产生的代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株l高产突变型正常株l低产突变型负变株（二）突变率（二）突变率u每一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变每一细胞或病毒粒在每一世代中发生
24、某一性状突变的几率的几率u亦可用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数亦可用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。常为目来表示。常为10-610-9 一般突变是独立发生的。突变的基因不会影响一般突变是独立发生的。突变的基因不会影响其他基因的突变率。其他基因的突变率。双重突变的概率是各个突变概率的乘积双重突变的概率是各个突变概率的乘积u如何测定某基因的突变率？如何筛选突变株？如何测定某基因的突变率？如何筛选突变株？回复突变株回复突变株 抗药性突变株抗药性突变株（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点u不对应性不对应性突变的形状与引起突变的原因间无直接的对应关系突变的形状与引起突变的原因
25、间无直接的对应关系u自发性：自发性：可自发的发生突变可自发的发生突变u稀有性稀有性突变几率很低而且较稳定（突变几率很低而且较稳定（10-610-9）u独立性独立性某种基因的突变率不受其他基因突变率的影响某种基因的突变率不受其他基因突变率的影响u可诱变性可诱变性诱变剂诱变剂Mutagen提高自突变的几率（提高自突变的几率（10-10-5），而自发），而自发突变与诱变间无本质上的差异。突变与诱变间无本质上的差异。u稳定性稳定性突变本质是遗传物质结构发生稳定的变化，所产生突变本质是遗传物质结构发生稳定的变化，所产生的新性状也是稳定的、可遗传的的新性状也是稳定的、可遗传的u可逆性可逆性性状的正向突变和
26、回复突变都可发生，几率相同性状的正向突变和回复突变都可发生，几率相同 正向突变正向突变Forward Mutation野生型基因变异为突变型基因的过程野生型基因变异为突变型基因的过程 回复突变回复突变Reverse/Bach Mutation由突变型向野生型表型的转变由突变型向野生型表型的转变u两种观点的碰撞l突变是生物对某特定环境（化学药物、抗生素和高温）的适应，环境是突变的诱因l抗性突变是自发产生的，即使是诱发突变，所产生的性状与诱发因素也是不对应的u证明实验l变量实验lNewcombe涂布实验lLederberg等的影印平板培养法（四）基因突变的自发性与不对应性证明（四）基因突变的自发性
27、与不对应（四）基因突变的自发性与不对应性的证明性的证明u变量实验变量实验lT1 sensitive E.colilT1 resistant E.colil方法学方法学 敏感菌株不能形成菌落敏感菌株不能形成菌落 平板涂布技术平板涂布技术2 2、涂布实验、涂布实验u试验原理试验原理l固体涂布平板法固体涂布平板法l敏感菌株不能形成单菌落敏感菌株不能形成单菌落l突变率的计算突变率的计算3 3、平板影印培养试验、平板影印培养试验uReplicate Platingu实验原理l抗药性突变l链霉素敏感的E.coli K12菌株平板影印试验平板影印试验影印平板影印平板基因突变的机制基因突变的机制基因突变的类型
28、诱发基因突变自发基因突变点突变畸变缺失易位倒位转换颠倒移码突变缺失添加碱基置换添加1、诱发突变u诱变（诱变（Induced MutationInduced Mutation）利用物理、化学或生物因素显著提高基因自利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段发突变频率的手段诱变剂（诱变剂（MutagenMutagen）：凡能提高突变率的任何）：凡能提高突变率的任何因素因素l碱基置换（碱基置换（SubstitutionSubstitution）l移码突变（移码突变（Frame-shift MutationFrame-shift Mutation）l染色体畸变（染色体畸变（Chromoso
29、mal aberrationChromosomal aberration）碱基置换碱基置换u染色体的微小损染色体的微小损一对碱基被另一对碱基所取代，包括一对碱基被另一对碱基所取代，包括转化和颠换，属于典型的点突变转化和颠换，属于典型的点突变导致置换的诱变剂导致置换的诱变剂u直接引起置换的诱变剂亚硝酸、亚硝基胍、硫酸二乙酯等u间接引起置换的诱变剂：碱基类似物5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤等碱基类似物作用：通过活细胞代谢活动掺入到DNA分子中移动码突变移动码突变u诱变剂会使DNA序列中的一个或几个氨基酸发生增添（插入）或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的 阅读筐架发生改
30、变，并进一步引起转录和转录错误的一类突变。u导致移码突变的诱变剂：吖啶类燃料染色体畸变u诱变剂（某些强烈理化因子如电离辐射X射线、烷化基、亚硝酸）除了引起点突变之外，还能引起染色体DNA分子的大损伤l缺失l重复l插入l易位l倒位l染色体数目变化自发突变自发突变u没有人工敢于条件下生物体自然发生的低频率突变u自发突变的诱导因素l背景辐射和环境因素l微生物自身有害代谢产物的诱导效应lDNA复制过程中碱基配对错误（六）紫外线对DNA损伤及修复Ultraviolet Ray作用机理作用机理DNA损伤的修复u光复活作用光裂合酶在可见光下使二聚体重新分解成单体u暗修复作用在暗处即可修复损伤的DNA、需核酸
31、内切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶二、突变与育种二、突变与育种u自发突变与育种自发突变与育种u诱变育种诱变育种自发突变与育种自发突变与育种u从生产中选育生产中菌自发突变及时选育出所需形状的正突变株Plus Mutantu定向培养优良品种用某特定环境长期处理某微生物群体，同时不断对其移种传代，以达到累积并选择合适的自发突变体的育种方法定向卡介苗牛结核杆菌牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上移种230多代显著减毒结核杆菌（卡介苗）诱变育种uBreeding by Induced Mutation理化诱变剂处理均匀、分散的微生物群体提高突变率巧妙筛选诱变：随机的过程筛选：定向的过程u诱变育种的实
32、践意义方法：简便易行，工作速度快，收效显著艾姆斯实验（艾姆斯实验（Ames test）可检出致癌物质：黄曲霉毒素、二甲氨偶氮苯、反应停等3 3、三类突变株的筛选方法、三类突变株的筛选方法u产量突变株的筛选u营养缺陷型突变株的筛选u抗药性突变株的筛选产量突变株的筛选产量突变株的筛选u春日酶素生产菌的筛选琼脂快培养法u琼脂块培养法可行的依据在哪里？营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选u营养缺陷型突变株筛选中应用的三种培养基u营养缺陷型突变有关的三类遗传个体u营养缺陷型的筛选方法三种培养基u基本培养基（MM，-）仅满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基u完全培养基（CM，+）凡可满足一切营
33、养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基u补充培养基（SM，A或B）凡可满足相应营养缺陷型生长需要的组合培养基补充培养基=基本培养基+缺陷的不能合成的代谢物。营养缺陷型突变有关的三类遗传个体营养缺陷型突变有关的三类遗传个体u野生型Wide Strain/Type从自然界分离到微生物在发生营养缺陷型突变前的原始菌株，可以在MM上生长，如A+B+u营养缺陷型Auxotroph只能在CM或相应的SM上生长。如A+B-u原养型Prototroph指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表现型上与野生型相同。营养缺陷型的筛选方法u获得野生菌株u诱变u淘汰野生型 抗生素法淘汰 菌丝过滤法u
34、检出和鉴定营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出u夹层培养法夹层培养法u限量补充培养法限量补充培养法u逐个检出法逐个检出法u影印平板法影印平板法MMMMMMCM夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法u将诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞迅速形成较大的菌落，而营养缺陷型细胞在营养受到限制的培养基上只能形成微小的菌落u欲获得某一特定的营养缺陷型菌株，只要在相应的基本培养基中添加微量的相应物质逐个检出法逐个检出法u细胞诱变处理u平板涂布在完全培养基上u接种针或灭菌牙签转接u培养观察影印平板法影印平板法营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定u生长谱法（Aux
35、anography）在混有供试菌的平板表面点加微量营养元素，视某营养物的周围是否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速的方法u操作过程 营养缺陷型细胞培养 制备菌种悬液 平板倾注，区域划分 添加营养物质粉末 培养观察第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种几个概念u微生物基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的稳定基因组的过程。u基因重组的方式真核有性杂交、准性杂交、原生质融合原核转化、转导、接合、原生质体融合基因重组可使生物体在未发生突变的情况，也能产生新的遗传型的个体一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组u原核生物的基因
36、重组的类型 转化 转导 接合 原生质体融合u特点 片段性：仅有一小段DNA序列参与重组 单向性：从供体菌到受体菌的单向转移 机制独特而多样（一）转化（Transformation）u定义受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换，把他整和到自己基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象u转化子通过转化方式而形成的杂种后代转化过程 受体细胞呈现感受态，即容易接受外源DNA的生理状态 外源DNA与感受态细胞结合并被吸收 外源DNA整和到受体菌中，成为受体菌染色体的一部分转染：指用提纯的病毒核酸去感染宿主细胞或原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象转化示意图肺炎双球菌转化示意图（一）转导（Tr
37、ansduction）u定义通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把一供体细胞的DNA片段转移到另一个受体细胞中，并使后者发生遗传变异的过程。u通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子（Transductant）。携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒普遍转导通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包装”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。一般用温和噬菌体作为媒介。流产性普遍转导简称流产转导，在许多获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导DNA不进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。（2）局限转导当溶源菌群经诱导后，
38、其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱离时产生误切割，从而把宿主的某些基因（前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal+或bio+）整和到噬菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体DNA与受体菌的DNA同源区配对，通过双交换而整和到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，而形成转导子（缺陷溶源菌）噬菌体噬菌体DNA的不正常切割的不正常切割u丢失了部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代的噬菌体称为缺陷噬菌体。u低频率转导（low frequancy transduction,LFT），形成转导子的频率很低，只有10-410-6u高频转导（high frequancy trans
39、duction,HFT），形成转导子的频率很高，理论上可达50%。溶源转变溶源转变u概念当正常温和噬菌体感染其宿主细胞而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整和到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性之外的新遗传性状的现象。u与转导的本质区别温和噬菌体不携带来自供体的外源基因温和噬菌体是完整的，噬菌体基因提供新性状获新性状的是溶原化的宿主细胞获得的新性状可随噬菌体的小时而同时消失（三）接合u概念供体菌通过性纤毛与受体菌相接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得新遗传性状的现象u接合子通过接合而获得新遗传性状的受体细胞u重组子E.coli的接合现象的接合现象u什么是F质粒
40、?决定大肠杆菌E.coli性别分化的质粒，是一种属于附加体性质的质粒，既可在细胞中单独存在，也可郑和到核染色体组上u通过接合获得；通过吖啶化合物、溴化乙锭或丝裂霉素处理而发生质粒消除 合成性菌毛基因的载体 决定细菌性别的物质基础四种结合型四种结合型E.coli菌株（菌株（F质粒在细胞内质粒在细胞内存在方式）存在方式）F+（“雄性”）菌株F-（“雌性”）菌株Hfr（高频重组）菌株F菌株F质粒的质粒的4种存在方式及相互关系种存在方式及相互关系F+（”雄性“）菌株u含F质粒，细胞表面有性菌毛，通过与F-菌株的接合，把DNA转移给F-菌株。F-（”雄性“）菌株u不含F质粒，细胞表面无性菌毛，可接受外源
41、DNA。接合的具体过程 F质粒的一条单链在特定位点产生缺口，形成供体单链DNA；以滚环模型方式复制F质粒，并以线形方式经过性菌毛传递到F-菌中；在受体细胞内线形外源DNA单链合成互补双链，经环化后形成新的F质粒。Hfr（高频重组）菌株uHigh frequency recombination StrainF质粒从游离态转变成在核染色体组特定位点质粒从游离态转变成在核染色体组特定位点上的整和态。上的整和态。uHfr菌株与菌株与F-菌株接合后发生基因重组的频率比菌株接合后发生基因重组的频率比单纯用单纯用F+菌株和菌株和F-菌株接合的频率要高数百倍菌株接合的频率要高数百倍Hfr与F-菌株的接合过程u
42、Hfr与与F-细胞配对细胞配对u通过性菌毛使两个细胞直接接触，并形成接合管通过性菌毛使两个细胞直接接触，并形成接合管u发生接合中断发生接合中断u外源双链外源双链DNA片段与受体菌的染色体片段与受体菌的染色体DNA双链双链进行双交换，产生稳定的接合子进行双交换，产生稳定的接合子F质粒uHfr菌株细胞内的F质粒由于不正常切割而脱离核染色体组时重新形成的游离的携带整和位点一小段核染色体基因的特殊F质粒，或F因子 初生F菌株 次生F菌株uF质粒转导、F因子转导、性导、F质粒媒介的转导以F质粒传递供体基因的方式初生F菌株和次生F菌株的由来（四）原生质体融合uProtoplast fusion通过人为方法
43、，使遗传性状不同的两个细胞的原生质发生融合，进而发生遗传重组以产生同时带双亲性状、遗传性稳定的重组子（融合子fusant）的过程。u进行原生质体融合的生物种类原核生物：细菌、放线菌真核生物：酵母菌、霉菌、和蕈菌、植物细胞、人和动物细胞原生质体融合的操作步骤原生质体融合的操作步骤Parent strain选择选择原生质体的制备原生质体的制备融合融合形成正常细胞形成正常细胞鉴定鉴定PEG电脉冲电脉冲原生质融合的操作示意图二、真核微生物的基因重组u有性杂交u准性杂交u原生质体融合u遗传转化（一）有性杂交（一）有性杂交（sexual hybridization）u概念一般指不同遗传型的两性细胞间发生的
44、 接合和随之发生的染色体重组，从而产生新遗传型后代的育种技术u进行有性杂交的微生物产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌S.cerevisiae的有性杂交的有性杂交u步骤 单倍体的制备含醋酸钠或其他产孢子培养基 接触杂交 有性杂交后代双倍体 优良个体筛选（一）准性生殖（一）准性生殖包括菌丝联接、异核体形成、核配和体细胞包括菌丝联接、异核体形成、核配和体细胞交换和单倍体化四个阶段交换和单倍体化四个阶段第四节 基因工程Gene EngineeringGenetic engineering基因工程的定义是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体（Vector）的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一些更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中”安家落户“，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。过程过程基因分离体外重组：外源DNA与载体连接载体传递：导入受体，使外源DNA在受体中表达复制、表达筛选、繁殖：对重组后的大量重组子性状进行筛选，从中选出所需性状重组子，并使之繁殖。基因工程的主要原理与操作步骤
