1、第八章第八章 微生物遗传变异微生物遗传变异与菌种保藏与菌种保藏(增加内容增加内容)本章内容：本章内容：第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础第二节第二节 基因突变及修复基因突变及修复第三节第三节 基因重组基因重组第四节第四节 微生物诱变育种微生物诱变育种第四节第四节 菌种的衰退、复壮及保藏菌种的衰退、复壮及保藏 第一节第一节 基因突变与诱变育种基因突变与诱变育种一、基因突变一、基因突变二、突变与育种二、突变与育种三、营养缺陷型的筛选三、营养缺陷型的筛选一一 基因突变基因突变（一）突变类型（一）突变类型（二）突变的特点（二）突变的特点（三）基因突变自发性及不对应性证明（三）基因突变自发性及不
2、对应性证明 （四）基因突变的机制（四）基因突变的机制 （五）（五）DNADNA的损伤及修复的损伤及修复 （一）突变类型（一）突变类型细胞形态细胞形态 1 1、形态突变型、形态突变型 菌落形态菌落形态 营养缺陷型营养缺陷型 2 2、生化突变型、生化突变型 抗性突变型抗性突变型 抗原性突变抗原性突变（包括细胞内部、表面成分的改变）（包括细胞内部、表面成分的改变）3 3、致死性突变型致死性突变型 （合成关键性酶的基因发生了突变，则表（合成关键性酶的基因发生了突变，则表现出致死突变）现出致死突变）条件致死突变型条件致死突变型 如突变为温度敏感型如突变为温度敏感型突变突变（3737死，死，25 25活）
3、活）4 4、其它突变型、其它突变型 毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。（二）（二）突变的特点突变的特点1 1 非对应性非对应性：环境与变异无对应性。：环境与变异无对应性。2 2 自发性自发性：非人为的诱变因素下发生。：非人为的诱变因素下发生。3 3 规律性规律性：某一特定性的突变率具规律性。：某一特定性的突变率具规律性。4 4 独立性独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。：一个基因的突变对其它基因突变无影响。5 5 稀有性稀有性：生物自发突变率为：生物自发突变率为1010-6-61010-12-12。6 6 诱变性诱变性：诱变剂可提高突变率：
4、诱变剂可提高突变率1010 10105 5X X。7 7 稳定性稳定性：突变性状稳定、可遗传。：突变性状稳定、可遗传。8 8 可逆性可逆性：有回复突变。：有回复突变。（三（三）基因突变自发性及不对应性的证明基因突变自发性及不对应性的证明 （自学）（自学）自发突变自发突变：没有人工诱变因素的参与，没有人工诱变因素的参与，生物体自然突变。生物体自然突变。1 1、彷徨试验：、彷徨试验：2 2、涂布试验：、涂布试验：3 3、平板影印、平板影印(Replica plating)Replica plating)培养试验：培养试验：彷徨试验彷徨试验（1 1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前）抗性细胞的出现
5、，是在接触噬菌体之前 （2 2）喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗）喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用；性株作用；（3 3）于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。）于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。平板影印培养试验平板影印培养试验涂布敏感菌涂布敏感菌5104个个共共12个平板个平板5104个菌落个菌落5000个细菌个细菌/菌落菌落喷入喷入T1保温保温重新涂布后重新涂布后 喷入喷入T1保温保温6个平板共个平板共353个菌落个菌落 6个平板共个平板共28个菌落个菌落（1 1）突变与噬菌体无关；）突变与噬菌体无关；（2 2）涂布使抗性菌株均匀分布；）涂布使抗性菌株均匀分布；（3 3）抗性突变可在
6、任何时间发生，与噬菌）抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。以上实验用统计学原理间接证明。影印培养影印培养无药无药培养基培养基含药含药培养基培养基影印培养试验影印培养试验 原始敏原始敏感菌种感菌种（1 1）实验表明：从未接触）实验表明：从未接触 str str 的菌株可发生抗的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的性突变，分离可得到纯的 str str 菌株。菌株。（2 2）由此表明：突变是自发的与环境不对应的。）由此表明：突变是自发的与环境不对应的。（四）基因突变的机制（自学）（四）基因突变的机制（自学）1 1 DNADNA的复制的复制（核苷酸对掺
7、入错误）（核苷酸对掺入错误）2 2 微生物自身产生诱变物质微生物自身产生诱变物质 （咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等）（咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等）3 3 环境对微生物的诱变作用环境对微生物的诱变作用 （辐射、加热等）（辐射、加热等）（五）（五）DNA损伤及修复（自学）损伤及修复（自学）1 1 光复活作用光复活作用2 2 切除修复切除修复3 3 重组修复重组修复4 4 SOSSOS修复修复二二 突变与育种突变与育种（一）自发突变与生产育种（一）自发突变与生产育种（二）诱变育种（二）诱变育种 （一）自发突变与生产育种（一）自发突变与生产育种1.1.生产选育生产选育：群体培养中个别的变异个体
8、表现群体培养中个别的变异个体表现出生长优势，发现突变种后，随出生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化时分离、纯化。2.2.定向培育定向培育：用特定的环境长期处理某一微生用特定的环境长期处理某一微生物群体物群体,同时不断对其移种、传代，同时不断对其移种、传代，以达到积累和选择合适的自发突变以达到积累和选择合适的自发突变 体的一种育种方法体的一种育种方法。（1 1）自发突变自发突变(spontaneous)spontaneous)：在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化引起的性状变异。引起的性状变异。（2 2）原因可能是）原因可能是：1 1）环境因素；）环境因
9、素；2 2）自身有毒产物的积累；）自身有毒产物的积累；3 3）互变异构效应；）互变异构效应；3 3、自发突变的机制自发突变的机制二二 诱变育种诱变育种1 1、概念、概念2 2、诱变剂、诱变剂3.3.诱变程序诱变程序4 4、诱变的主要环节、诱变的主要环节1 1、概念、概念 诱变育种诱变育种是用物理或化学的是用物理或化学的诱变剂诱变剂使使诱变对象内的遗传物质（诱变对象内的遗传物质（DNADNA）的分子结的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。得符合要求的变异菌株的一种育种方法。（1 1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素
10、。概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。（2 2）种类：种类：1 1）物理因子（）物理因子（phisical agents)phisical agents)物理诱变剂：物理诱变剂：U.VU.V、快中子、超声波等。快中子、超声波等。2 2）化学因子）化学因子(chemical agents)chemical agents)3 3）转座子转座子(transposable elements)transposable elements)2 2、诱变剂、诱变剂 烷化剂烷化剂(alkylating agents)alkylating agents)：如如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、：氮芥、硫酸二乙酯、亚
11、硝基胍、NTGNTG等等 机制机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质。：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质。化学诱变剂化学诱变剂：碱基类似物碱基类似物(base analogs)base analogs)：如如：叠氮胸腺嘧啶（：叠氮胸腺嘧啶（AITAIT）等；等；机制机制：在：在DNADNA复制时将碱基类似物插入复制时将碱基类似物插入DNADNA中，而碱基中，而碱基 类似物没有正常碱基的氢键性质，在类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNADNA复制时复制时 出现突变体。出现突变体。插入剂插入剂(intercalating agents):intercalating agents):如如：溴化乙
12、啶等一些三环分子。：溴化乙啶等一些三环分子。机制机制：与：与DNADNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些中的一对碱基有大致相同的位点，这些分子不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋分子不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间距，引起碱基增加中，加宽间距，引起碱基增加。t 3.3.诱变程序：诱变程序：原始菌种原始菌种 原菌种特性鉴定原菌种特性鉴定 纯化纯化 斜面斜面/肉汤肉汤 培养单孢子培养单孢子/单细胞悬液单细胞悬液 诱变剂处理诱变剂处理 计算存活率计算存活率 平板分离平板分离 观察形态变异，挑单菌落观察形态变异，挑单菌落 移至斜面移至斜面 初筛初筛 复筛复筛 小试小试 良种保藏良种保藏
13、 中试中试4 4 诱变的主要环节诱变的主要环节（1）诱变剂的选择）诱变剂的选择（2）出发菌株的选择）出发菌株的选择（3）单孢子或单细胞悬液的制备单孢子或单细胞悬液的制备（4 4）设计和采用效率高的筛选方案和方法）设计和采用效率高的筛选方案和方法（1 1）诱变剂的选择：）诱变剂的选择：1 1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。2 2）处理方式）处理方式 A A、单一因子处理：先后使用单一因子处理：先后使用 B B、复合因子处理：两种以上因素同时使用单一复合因子处理：两种以上因素同时使用单一 因子重复使用。因子重复使用。3 3）处理剂量：测致死率。）处理
14、剂量：测致死率。方法：平板菌落计数法、方法：平板菌落计数法、纸片法纸片法 一般杀菌率为一般杀菌率为70%70%左右。左右。（2 2）出发菌株：）出发菌株：育种的原始菌种应具备：育种的原始菌种应具备：1 1）对诱变剂的敏感性高；）对诱变剂的敏感性高；2 2）生产中选育过的自发变异菌株；）生产中选育过的自发变异菌株；3 3）本身具有一些有利性状；）本身具有一些有利性状；4 4）对代谢产物有一定积累；）对代谢产物有一定积累；5 5）已经发生过某些变异。）已经发生过某些变异。（3 3）单孢子或单细胞悬液的制备）单孢子或单细胞悬液的制备 1 1）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不）必要性：单细
15、胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不纯的菌落纯的菌落菌种退化。菌种退化。2 2）制备：）制备：物理诱变剂物理诱变剂生理盐水（生理盐水（0.85%0.85%NaCl)NaCl)化学诱变剂化学诱变剂缓冲液。缓冲液。3 3）方法：）方法：三角瓶内加三角瓶内加0.5cm0.5cm玻璃珠打散玻璃珠打散10-1510-15min;min;加加.3%.3%吐温吐温8080（表面活性剂），用无菌脱脂（表面活性剂），用无菌脱脂棉过滤。棉过滤。4 4）浓度：）浓度：细菌、放线菌细菌、放线菌 108 108个个/ml ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 106 106个个/mlml （4 4）设计和采用效率高的筛选方案和方
16、法）设计和采用效率高的筛选方案和方法 1 1）初筛：）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的生理效应范围。生理效应范围。方法方法 梯度平板法（抗性菌株）梯度平板法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）变色圈法（氨基酸生产菌株）变色圈法（氨基酸生产菌株）2 2）复筛）复筛：（见：（见P250P250）较精确的生物化学分析方法较精确的生物化学分析方法做摇瓶测定做摇瓶测定 三、营养缺陷型的筛选三、营养缺陷型的筛选（一）概念（一）概念（二）筛选方法（二）筛选方法（一）概念（一）概念1.1.
17、三种遗传型个体三种遗传型个体2 2、筛选用的培养基、筛选用的培养基1.1.三种遗传型个体三种遗传型个体（1 1）营养缺陷型（）营养缺陷型（auxotrophauxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：如：lys-;bio-;lys-;bio-;（2 2）野生型野生型(wild type)wild type)：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。变前
18、的原始菌株，为该微生物的野生型。如：如：lys+;bio+;lys+;bio+;（3 3）原养型原养型(prototroph)prototroph)：指指auxoauxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。型的表型相同。2 2、筛选用的培养基、筛选用的培养基1 1）基本培养基（）基本培养基（minimal medium,MMminimal medium,MM）-：满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。2 2）完全培养基（）完全培养基（complete medium,CMcomplete medi
19、um,CM）+：满足一切满足一切auxoauxo生长的天然或半组合培养基。生长的天然或半组合培养基。3 3）补充培养基（）补充培养基（supplemented medium,SMsupplemented medium,SM）x x：在在MMMM中有针对性地加入一或几种营养成分中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应以满足相应 auxoauxo生长的组合培养基。生长的组合培养基。（二）筛选方法（二）筛选方法1 1、诱变处理、诱变处理2 2、auxoauxo的浓缩的浓缩3 3、auxoauxo的检出的检出4 4、auxoauxo的鉴定的鉴定5 5、auxoauxo的应用的应用 1.诱变处理（同前
20、)auxoauxo的筛选程序：的筛选程序：细菌培养细菌培养 离心洗涤离心洗涤 诱变处理诱变处理 CMCM后培养后培养 洗涤洗涤 MMMM加加PN PN 涂布于涂布于CMCM平板平板 影印培养影印培养 挑取挑取 鉴定鉴定 菌种保存。菌种保存。2.2.auxoauxo的浓缩：的浓缩：（1 1）抗生素法：）抗生素法：1 1）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。微生物细胞，对休止态细胞无作用。2 2）方法：菌培养在含抗生素的）方法：菌培养在含抗生素的MMMM基中。基中。（2 2）菌丝过滤法：）菌丝过滤法：1 1）适用
21、于丝状（放线菌、霉菌）适用于丝状（放线菌、霉菌）2 2）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxoauxo孢子可孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。通过滤膜，野生型菌丝不能通过。（3 3）差别杀菌法：）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留死野生型营养体，保留auxoauxo芽孢。细菌芽孢。细菌80 80 酵母酵母60 60 适用于产芽孢、孢子菌。适用于产芽孢、孢子菌。3.3.auxoauxo的检出的检出（1 1）逐个检出法）逐个检出法（2 2）影印平板培养法）影印平板培养法（3 3）限量补充法）
22、限量补充法 （在（在mmmm中加中加0.01%0.01%蛋白胨，蛋白胨，auxoauxo菌落小，野生型大）菌落小，野生型大）（4 4）夹层培养法）夹层培养法4 4.auxoauxo的鉴定的鉴定（1 1）生长谱法）生长谱法 1 1）方法简便；）方法简便；2 2）回变和污染不影响结果）回变和污染不影响结果 3 3）测定物质可为粉末或纸片）测定物质可为粉末或纸片（2 2）混合氨基酸（）混合氨基酸（VitVit）法法混合氨基酸法步骤：混合氨基酸法步骤：1 1）将多种营养因子编组，如：）将多种营养因子编组，如：2 2）将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养）将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养 3
23、 3）结果分析）结果分析4 4）营养因子分组编排时注意：）营养因子分组编排时注意：A A、每组内无重复的营养因子每组内无重复的营养因子 B B、每组中应包含只出现一次的因子每组中应包含只出现一次的因子 C C、每组中其他因子应分别出现二次每组中其他因子应分别出现二次一组：一组：1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 二组：二组：2 6 7 8 9 2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 13 14 4 8 11 13 14 五组：五组：5 9 12 14 155 9 12 14 155.5.auxoauxo 的应用的应用（1
24、 1）作为标记菌株）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种、代谢过程的进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记；研究中的亲本标记；（2 2）作为生产菌种）作为生产菌种：aaaa、核苷酸等生产菌种；核苷酸等生产菌种；（3 3）作为）作为aaaa、维生素、碱基的测定菌株。维生素、碱基的测定菌株。第二节第二节 基因重组基因重组一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组 二、真核生物的基因重组二、真核生物的基因重组基因重组基因重组把两个把两个不同性状不同性状个体内的遗传基因个体内的遗传基因转移转移到到一起一起，经，经遗传物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。遗传物质重新组合后，形成新遗传型
25、个体的方式。基因重组基因重组分子水平的杂交分子水平的杂交 一般杂交一般杂交细胞水平细胞水平如：如：甲甲 乙乙生长快、产量低生长快、产量低 生长慢、产量高生长慢、产量高 基因重组基因重组 生长快、产量高生长快、产量高一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组（一）转化（一）转化（transformation)transformation)（二）转导二）转导(transduction)transduction)（三）接合三）接合(conjugation)conjugation)（四）原生质体融合（四）原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）（一）转化（
26、一）转化（transformation)transformation)概念概念 受体细胞受体细胞(receptor)receptor)直接吸收了来自供体细胞直接吸收了来自供体细胞(donor)donor)的的DNADNA片断，并把它整合到自己的基因组中片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。1.1.感受态感受态2.2.感受态因子感受态因子3.3.转化因子转化因子4.4.转化的检出转化的检出 （1 1）感受态）感受态：受体细胞最易接受外源：受体细胞最易接受外源DNADNA片段并片段并实现其转化的一种生理状态。实现其转化的一种
27、生理状态。（2 2）转化的决定因素）转化的决定因素：不同菌株的亲缘关系：不同菌株的亲缘关系;受受 体细胞是否处于感受态；不同菌出现体细胞是否处于感受态；不同菌出现感受态的时间不同。感受态的时间不同。1.1.感受态感受态 一种胞外蛋白质，分子量为一种胞外蛋白质，分子量为5 51010kDkD其作用为：其作用为：（1 1）催化转化）催化转化，促进外来，促进外来DNADNA片段吸收。片段吸收。（2 2）可降解细胞表面某种成分）可降解细胞表面某种成分，使使DNADNA受体暴露受体暴露。1 1）不同菌细胞）不同菌细胞DNADNA受体位点不同。受体位点不同。2 2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用。）有的
28、菌感受态因子只对同种菌起作用。2.2.感受态因子感受态因子3.3.转化因子转化因子（1 1）转化因子由供体提供转化因子由供体提供（2 2）一般为线状或闭合环状；单链或双链；一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链双链 有转化能力，单链没有。有转化能力，单链没有。（3 3）自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里 通过提取获得。通过提取获得。（4 4）转化的频率往往很低，一般为转化的频率往往很低，一般为0.10.11%1%。据研究，。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高。化频率最高。游离的片断叫转化因子游离的片断叫转化因子4.4.转化的检出转化的检出甲甲-受体受体strrstrr，lys-lys-在含在含strstr的的MMMM上培养上培养乙乙-供体供体strsstrs，lys+lys+如出现如出现strrstrr，lys+lys+的菌株，则表明已经转化的菌株，则表明已经转化。
