1、第七章第七章 抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用n免疫沉淀与免疫凝集免疫沉淀与免疫凝集n免疫标记免疫标记n免疫定位分析免疫定位分析n抗原抗体反应的其他应用抗原抗体反应的其他应用n免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析。这类分析方法具抗原或抗体进行量或质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点，有的可以表现出一个氨有特异、灵敏和快速的特点，有的可以表现出一个氨基酸分子的差异，如用单克隆抗体进行检测的方法；基酸分子的差异，如用单克隆抗体进行检测的方法；测定的量可以达到测定的量可以达到g甚至甚至ng的水平
2、，如的水平，如ELISA法，法，放射免疫法等；反应在几小时，几分钟甚至更短的时放射免疫法等；反应在几小时，几分钟甚至更短的时间可以看到测定的结果，如免疫沉淀法等。间可以看到测定的结果，如免疫沉淀法等。n这类免疫分析的方法可以用于医学，免疫学中抗原抗这类免疫分析的方法可以用于医学，免疫学中抗原抗体的分析体的分析(包括病原的诊断，免疫细胞表面分子的检包括病原的诊断，免疫细胞表面分子的检测等测等)，而且可以广泛的用于生命科学的几乎各个领，而且可以广泛的用于生命科学的几乎各个领域，甚至于食品科学，环境科学及分析化学等更为广域，甚至于食品科学，环境科学及分析化学等更为广泛的学科领域。泛的学科领域。n一、
3、免疫沉淀与免疫凝集一、免疫沉淀与免疫凝集n1溶液中的沉淀反应溶液中的沉淀反应 在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀免疫沉淀(immunoprecipitation)反应，表明两者之间有特反应，表明两者之间有特异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定量异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验(ring
4、precipitant test)(图图7l0)。沉淀试验可以在玻璃管中。沉淀试验可以在玻璃管中进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层轻轻铺进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层轻轻铺上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了使界面更上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了使界面更好地形成，常在下层抗原溶液中加入好地形成，常在下层抗原溶液中加入10的蔗糖或甘油。的蔗糖或甘油。抗原抗体溶液置于抗原抗体溶液置于37或或4孵育后，在界面上形成白色沉孵育后，在界面上形成白色沉淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。2.凝胶扩散沉淀凝胶扩
5、散沉淀 抗原抗体可在半透明的半固相介质中进抗原抗体可在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子和抗体分子在凝胶行沉淀实验。抗原分子和抗体分子在凝胶介质中自由扩形成浓度梯度，抗原与抗体介质中自由扩形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。凝胶沉淀可用于测定抗原或抗体的相线。凝胶沉淀可用于测定抗原或抗体的相对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、纯度及相互关系。最常用的方法为纯度及相互关系。最常用的方法为单向免单向免疫扩散疫扩散(radial immuno diffusion)和和双向双向免疫扩散免疫扩
6、散(doubleimmunodiffusion)。单向扩散法又称单向扩散法又称Mancini Mancini 法，将适当浓度的抗体法，将适当浓度的抗体混于琼脂混于琼脂(0(08 811)中，琼脂凝中，琼脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉淀环。沉淀环的面积与抗原浓度呈正相关。通过淀环。沉淀环的面积与抗原浓度呈正相关。通过与已知抗原浓度形成的沉淀环面积进行比较，可与已知抗原浓度形成的沉淀环面积进行比较，可确定被测抗原的浓度确定被测抗原的浓度(图图711)711)。单扩散
7、常用于测。单扩散常用于测定血清中定血清中IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA及补体的含量。及补体的含量。单扩散法的特点使用抗体浓度大，当抗原浓度低单扩散法的特点使用抗体浓度大，当抗原浓度低于于510g510gmLmL则不适用。则不适用。双扩散法又称为双扩散法又称为OuchterlonyOuchterlony法，在琼脂板中抗原和抗法，在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。琼脂双扩散常用于间二者比例合适的部位形成沉淀线。琼脂双扩散常用于分析抗原间的血清学关系和抗体间差异，相邻孔中不同分析
8、抗原间的血清学关系和抗体间差异，相邻孔中不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化显示抗抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。当两个抗原完全原间是否存在共同的抗原决定簇。当两个抗原完全致致时，两条沉淀线完全融合时，两条沉淀线完全融合(图图712A)712A)；如果两个抗原无；如果两个抗原无共同抗原决定簇而抗血清中有针对两种抗原的抗体时，共同抗原决定簇而抗血清中有针对两种抗原的抗体时，沉淀线互不干扰，呈交叉状沉淀线互不干扰，呈交叉状(图图712B)712B)；当两个抗原只；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，是部分抗原决定簇相同
9、，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺则沉淀线在后者一方形成突出的小刺(图图712C)712C)。此外，。此外，根据抗体或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀线。根据抗体或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀线。OuchterlonyOuchterlony法灵敏度不高，形成沉淀线需较长时间法灵敏度不高，形成沉淀线需较长时间(1824h)(1824h)。但在抗原分析方面很有实用价值。但在抗原分析方面很有实用价值。3 3免疫电泳免疫电泳免疫扩散沉淀形成需较长时间，且灵敏度低。免疫电泳免疫扩散沉淀形成需较长时间，且灵敏度低。免疫电泳（immunoelectrphoresis）是
10、利用蛋白质在凝胶中电泳迁移）是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。这种方法能提高分辨率和灵敏度。混合的蛋白质抗原在法。这种方法能提高分辨率和灵敏度。混合的蛋白质抗原在PH 86时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混合的抗原组分得以分离，而抗体可以通过自由扩散，也可使混合的抗原组分得以分离，而抗体可以通过自由扩散，也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线。从而提高以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线。从而提高免疫沉淀的灵敏
11、度。常见的免疫电泳方法有血清免疫电泳，火免疫沉淀的灵敏度。常见的免疫电泳方法有血清免疫电泳，火箭电泳和对流免疫电泳箭电泳和对流免疫电泳(又称电渗析又称电渗析)。传统的免疫电泳即指血。传统的免疫电泳即指血清免疫电泳，将抗原混合物清免疫电泳，将抗原混合物(病人血清病人血清)在凝胶中用电泳分离后，在凝胶中用电泳分离后，沿电冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双扩散。沉淀沿电冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加组分的缺少或增加(图图713)。火箭电泳火箭电泳(ro
12、cket electrophoresis)，为单向免疫扩散与电泳，为单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。已混合有抗体的凝胶上，做一小孔，加入结合的一种方法。已混合有抗体的凝胶上，做一小孔，加入抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀线，沉淀线的抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀线，沉淀线的高度与抗原量成正比高度与抗原量成正比(图图714)。火箭电泳可用于定量测定，。火箭电泳可用于定量测定，例如用于测定人血清中的甲胎蛋白。例如用于测定人血清中的甲胎蛋白。4.免疫共沉淀免疫共沉淀 免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的菌蛋
13、白质的“protein A/G特异性地结合到抗体特异性地结合到抗体(免疫球蛋白免疫球蛋白)的的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结预先结合在合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。二、免疫标记二、免疫标记1放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析法放射
14、免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)的应用始于的应用始于60年年代末，广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、代末，广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、可靠的免疫分析方法之一。常用来标记抗原或抗体的同位素有可靠的免疫分析方法之一。常用来标记抗原或抗体的同位素有125I，131I，3H和和35S。放射活性的检测液相反应体系用液体闪。放射活性的检测液相反应体系用液体闪烁仪计数，而固相体系可用烁仪计数，而固相体系可用X射线胶片显影。射线胶片显影。125I 为为 射线射线(0.035meV)，131I 有硬有硬 射线射线(0.608meV)和和 射射线线(
15、0.36meV)两种，半衰两种，半衰期为期为60 d，放射性碘标记常用氯胺，放射性碘标记常用氯胺T法法(chloraminesT)。氯胺。氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子(I-)氧化为单质碘氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应。应。氚氚(3H)因其放射性损伤小因其放射性损伤小(软软 射线、射线、0.0185meV)，物理半，物理半衰期长衰期长
16、(1226 年年)而生物半衰期短，属低毒型放射性同位素，而生物半衰期短，属低毒型放射性同位素，用于标记免疫分子更合适。常用用于标记免疫分子更合适。常用N琥珀酰亚胺琥珀酰亚胺2，33H丙酸酯标记抗原或抗体分子，其活泼酯基易和蛋白质的游离丙酸酯标记抗原或抗体分子，其活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应氨基反应：标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般用电泳，沉淀，离子变换层析，高压液相层析及超速离心等方法用电泳，沉淀，离子变换层析，高压液相层析及超速离心等方法将标记物纯化，但最方便的方法是凝胶过滤，透析及超滤。将标记物纯化，但最方
17、便的方法是凝胶过滤，透析及超滤。放射标记的抗原或抗体可直接用于抗原抗体反应，形成的抗原抗放射标记的抗原或抗体可直接用于抗原抗体反应，形成的抗原抗体反应复合物，用第体反应复合物，用第抗体或聚乙二醇沉淀分离后，测定其放射抗体或聚乙二醇沉淀分离后，测定其放射活性用于定量抗原或抗体。为了提高灵敏度，应用竞争法进行活性用于定量抗原或抗体。为了提高灵敏度，应用竞争法进行抗原或抗体定量，其放射活性与被测抗原或抗体呈反比抗原或抗体定量，其放射活性与被测抗原或抗体呈反比(图图717)。2 2酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验同位素标记的免疫分析方法，虽然有较高的灵敏度，但同位同位素标记的免疫分析方法，虽然有较高的
18、灵敏度，但同位素具有不稳定，需要特殊设备。安全性差，废物处理麻烦等素具有不稳定，需要特殊设备。安全性差，废物处理麻烦等缺点限制了其使用。非放射性标记方法逐步得到发展，其中缺点限制了其使用。非放射性标记方法逐步得到发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。因酶促反应使测定的结酶标记免疫试验是广泛使用的方法。因酶促反应使测定的结果被放大，反应的灵敏度接近放射免疫分析法。用于标记的果被放大，反应的灵敏度接近放射免疫分析法。用于标记的酶的种类也越来越多，较常用的有碱性磷酸酶酶的种类也越来越多，较常用的有碱性磷酸酶(alkalinephosphatase(alkalinephosphatase)、辣根过
19、氧化物、辣根过氧化物(horseradish(horseradish peroxidaseperoxidase)、半乳糖苷酶半乳糖苷酶galactosidasegalactosidase)和脲酶和脲酶(urease(urease)等。酶免疫试验法等。酶免疫试验法(enzyme immunoassay(enzyme immunoassay，EIA)EIA)有两有两类方法，一类为均相法，即抗原与抗体反应后，不必将结合类方法，一类为均相法，即抗原与抗体反应后，不必将结合的与游离的抗原或抗体分离，就可测定被测分子的含量。如的与游离的抗原或抗体分离，就可测定被测分子的含量。如酶放大免疫分折技术酶放大免疫
20、分折技术(enzyme multiplied immunoassay(enzyme multiplied immunoassay，EMIT)EMIT)，将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，当抗体，将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，当抗体与这些抗原结合后，封闭了酶催化位点，使酶失去活性。与这些抗原结合后，封闭了酶催化位点，使酶失去活性。如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物也可以竞争方式检测抗原的含量，另一类为固相法，即将抗原或抗体也可以竞争方式检测抗原的含量，另一类为固相法，即将抗原或抗体吸附在固相表面
21、，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原与抗体反应吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附试试(enzymelinked immunosorbent(enzymelinked immunosorbent assay assay，ELISA)ELISA)。ELISAELISA有直接法、间接法及夹心法等不同反应方式。直接法有直接法、间接法及夹心法
22、等不同反应方式。直接法(direct(direct ELISA)ELISA)是指用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗是指用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，被检抗原或抗体的量与产物颜色成正比原，被检抗原或抗体的量与产物颜色成正比(图图718A)718A)；间接法；间接法(indirect ELISA)(indirect ELISA)是将酶标记在第二抗体上，当抗原与第一抗体结合后，是将酶标记在第二抗体上，当抗原与第一抗体结合后，再用酶标第二抗体来检查第一抗体是合与抗原结合。有酶底物显色的反再用酶标第二抗体来检查第一抗体是合与抗原结合。有酶底物显色的反应为正反应
23、，反之为负反应应为正反应，反之为负反应(图图718B)718B)。夹心法。夹心法(sandwich ELISA)(sandwich ELISA)先用先用一种未标记的抗体包被酶标板，用于捕获抗原分子，再用标记的具有相一种未标记的抗体包被酶标板，用于捕获抗原分子，再用标记的具有相同抗原特性但来源于不同种类动物的抗体与之反应。也可用间接法中的同抗原特性但来源于不同种类动物的抗体与之反应。也可用间接法中的第二抗体进行该项反应第二抗体进行该项反应(间接夹心法间接夹心法)()(图图718C)718C)。夹心法可用于检测抗。夹心法可用于检测抗原，尤其是小分子的抗原，也可以用于检测抗体。原，尤其是小分子的抗原
24、，也可以用于检测抗体。用酶标记的第二抗体进行间接用酶标记的第二抗体进行间接ELISAELISA，避免了用酶标记每一种抗原，避免了用酶标记每一种抗原或抗体的复杂过程，因而得到更广泛的应用。常用的羊抗鼠或抗体的复杂过程，因而得到更广泛的应用。常用的羊抗鼠IgGIgG、羊抗、羊抗免免IgGIgG 及羊抗人及羊抗人IgGIgG 的酶交联物已经商品化，可根据需要选择合适酶的酶交联物已经商品化，可根据需要选择合适酶标第二抗体。不同的酶催化的底物不同，显色产物的吸收波长也不一标第二抗体。不同的酶催化的底物不同，显色产物的吸收波长也不一样样(表表174)174)。酶标比色仪呵进行光吸收的测量。酶标比色仪呵进行
25、光吸收的测量。斑点酶免疫试验斑点酶免疫试验(dotELISA)(dotELISA)：ELISA ELISA 一般是在液相中进行酶底一般是在液相中进行酶底物显色反应的，所以反应产物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸物显色反应的，所以反应产物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸收法测定反应的强度。收法测定反应的强度。dotELISAdotELISA的原理与普通的原理与普通ELISAELISA相同，只是把相同，只是把反应全部移到硝酸纤维素膜上进行，而不是在聚苯乙烯酶标板上进行。反应全部移到硝酸纤维素膜上进行，而不是在聚苯乙烯酶标板上进行。即把抗原、第一抗体、第二抗体都依次加到膜上，洗脱未反应物及封即把
26、抗原、第一抗体、第二抗体都依次加到膜上，洗脱未反应物及封闭反应物以外的膜表面都与普通闭反应物以外的膜表面都与普通ELISAELISA相同。最后的显色反应是用另相同。最后的显色反应是用另外一类底物，这类底物反应的产物是不溶于水的有色沉淀物，如碱性外一类底物，这类底物反应的产物是不溶于水的有色沉淀物，如碱性磷酸酶的底物要用磷酸酶的底物要用BCIPBCIPNBTNBT，而不能用，而不能用pNPPpNPP。根据膜上沉淀物颜色。根据膜上沉淀物颜色有无与深浅判断反应的正负和量的多少。斑点扫描仪也可以帮助定量。有无与深浅判断反应的正负和量的多少。斑点扫描仪也可以帮助定量。dotELISAdotELISA的优
27、点是灵敏度比普通的优点是灵敏度比普通ELISAELISA高高1010010100倍，与放射免疫的倍，与放射免疫的灵敏度水平相当。灵敏度水平相当。3 3荧光与发光免疫分析荧光与发光免疫分析 用于标记抗体的荧光化合物有异硫青荧光素用于标记抗体的荧光化合物有异硫青荧光素(FITC)(FITC)和罗和罗丹明丹明(rhodamine(rhodamine)荧光素等，适用于抗原细胞和组织的定位荧光素等，适用于抗原细胞和组织的定位分析。近年来用稀土元素分析。近年来用稀土元素(镧系元素镧系元素)的铕离子的铕离子(Eu3+)(Eu3+)、铽离、铽离子子(Tb3+)(Tb3+)等代替荧光素标记抗体，将时间分辨技术引
28、入生物等代替荧光素标记抗体，将时间分辨技术引入生物检测领域，建立了时间分辨荧光免疫分析法检测领域，建立了时间分辨荧光免疫分析法(time(timeresolved fluorommunoassayresolved fluorommunoassay，TrFIATrFIA)，明显提高了荧光免，明显提高了荧光免疫分析技术的灵敏度和特异性。疫分析技术的灵敏度和特异性。TrFIATrFIA的测定原理与荧光免疫分析法不同，当铕离子螯的测定原理与荧光免疫分析法不同，当铕离子螯合物标记抗体后，抗体与固相化的特异性抗原结合，抗体上合物标记抗体后，抗体与固相化的特异性抗原结合，抗体上的的Eu3+Eu3+在紫外光在
29、紫外光(340nm)(340nm)激发下，与增强液中的激发下，与增强液中的二酮体重二酮体重新形成新形成种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光(613nm)(613nm)，比未激发时增强了，比未激发时增强了100 100 万倍万倍(图图719)719)，可用时间，可用时间分辨荧光计记录下来。分辨荧光计记录下来。稀土元素的荧光激发波长范围较宽稀土元素的荧光激发波长范围较宽300300380nm)380nm)，有利于增高激发能，提高标记抗体的灵敏性；，有利于增高激发能，提高标记抗体的灵敏性；而发射波长很窄而发射波长很窄(613nm)(613nm)，造成激发波长和
30、发射波长之，造成激发波长和发射波长之间的差别很大间的差别很大(270nm)(270nm)，有利于降低背景，利用干涉滤，有利于降低背景，利用干涉滤片排除散射荧光的干扰。片排除散射荧光的干扰。稀土元素产生的荧光不但强度高，而且半衰期长稀土元素产生的荧光不但强度高，而且半衰期长(10(10100s)100s)，比普通荧光素高出，比普通荧光素高出5656个数量级。利个数量级。利用延迟测量时间可消除来自样品，试剂等的干扰。稀用延迟测量时间可消除来自样品，试剂等的干扰。稀土元素用双功能基团螯合剂，如异硫酸土元素用双功能基团螯合剂，如异硫酸苯基苯基乙二乙二胺四乙酸可标记至抗体的酪氨酸和组氨酸残基上。标胺四乙
31、酸可标记至抗体的酪氨酸和组氨酸残基上。标记方法简单方便，稳定性好，可使用记方法简单方便，稳定性好，可使用1212年的时间。年的时间。发光免疫分析发光免疫分析(luminescent immunoassay(luminescent immunoassay，LIR)LIR)也是也是近年发展起来的一项免疫分析新技术。用发光物质标记抗近年发展起来的一项免疫分析新技术。用发光物质标记抗体或抗原。其反应原理与体或抗原。其反应原理与ELISAELISA、RIARIA、FIA FIA 等类似。根据等类似。根据发光物的来源不同，有化学发光发光物的来源不同，有化学发光(chemiluminessence(chem
32、iluminessence)和生物发光和生物发光(bioluminescence)(bioluminescence)不同方法。不同方法。一些化学发光剂如荧光醇一些化学发光剂如荧光醇(1uminol)(1uminol)，可用于标记抗，可用于标记抗原或抗体，反应时发光剂发生高能化学反应，形成处于电原或抗体，反应时发光剂发生高能化学反应，形成处于电子激发态的分子，当这些产物分子回到基态时，伴随着光子激发态的分子，当这些产物分子回到基态时，伴随着光子的释放，发生化学发光现象。荧光醇在标记过程中易丢子的释放，发生化学发光现象。荧光醇在标记过程中易丢失发光能力，异荧光醇失发光能力，异荧光醇(iso1umi
33、nol)(iso1uminol)相对更稳定一些。一相对更稳定一些。一些发光分子的发光反应需要阳离子或酶的催化，还有一些些发光分子的发光反应需要阳离子或酶的催化，还有一些化学发光分子如吖啶酯化学发光分子如吖啶酯 (acridine(acridine ester)ester)则不需催化剂则不需催化剂的作用，只需在酸性条件下用过氧化氢诱导化学发光。目的作用，只需在酸性条件下用过氧化氢诱导化学发光。目前把化学发光剂与发光增强剂结合使用，使光强度达到前把化学发光剂与发光增强剂结合使用，使光强度达到X X光光胶片曝光的要求。胶片曝光的要求。生物发光常见的反应系统为虫荧素生物发光常见的反应系统为虫荧素(lu
34、ciferin(luciferin)在虫荧在虫荧酶酶(lucifase(lucifase)的催化下，有的催化下，有ATPATP，Mg2+Mg2+及及O2O2存在发生存在发生瞬时发光反应：瞬时发光反应：发光反应可用瞬时荧光仪检测记录，也可用胶片显影。发光反应可用瞬时荧光仪检测记录，也可用胶片显影。4 4亲和标记的免疫分析亲和标记的免疫分析 金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的A A蛋白与蛋白与IgG FcIgG Fc段有高度的亲和段有高度的亲和力。用酶、同位素、荧光素等标记力。用酶、同位素、荧光素等标记A A蛋白，替代第二抗蛋白，替代第二抗体直接与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。体直接与抗体结合
35、，可用于抗原抗体反应的分析。A A蛋蛋白对不同种动物来源的白对不同种动物来源的IgGIgG 均有亲和性，可用于多数抗均有亲和性，可用于多数抗原抗体反应的分析，但有些动物的原抗体反应的分析，但有些动物的IgGIgG 或少数亚类不与或少数亚类不与A A蛋白结合，选择时应注意蛋白结合，选择时应注意(见第三章见第三章)。生物素。生物素(biotin)(biotin)是一种维生素，存在于多种生物组织中，也可以人工合是一种维生素，存在于多种生物组织中，也可以人工合成，能特异性地与来自卵蛋白的亲和素成，能特异性地与来自卵蛋白的亲和素(avidin(avidin)或链霉或链霉菌的链亲合素菌的链亲合素(stre
36、pavidin(strepavidin)结合。生物素与亲和素有结合。生物素与亲和素有很高的亲和力，比抗原抗体结合的亲和力高很高的亲和力，比抗原抗体结合的亲和力高104 104 倍，并倍，并且一个亲和素分子可与多个生物素分子结合。且一个亲和素分子可与多个生物素分子结合。全物素是小分子化合物全物素是小分子化合物(相对分子质量为相对分子质量为224)224)，能通过双功，能通过双功能连接剂能与抗原、抗体、酶等大分子上氨基、羧基及糖能连接剂能与抗原、抗体、酶等大分子上氨基、羧基及糖基共价结合。基共价结合。个大分子上可以标记数个生物素分子。链个大分子上可以标记数个生物素分子。链亲和素是相对分子质量为亲和
37、素是相对分子质量为6 68 8l04l04的大蛋白质，可用酶、的大蛋白质，可用酶、荧光素等标记。标记后的生物素不影响其与亲和素的结合，荧光素等标记。标记后的生物素不影响其与亲和素的结合，因此在免疫分析中得到广泛的应用。一些不易制备抗体的因此在免疫分析中得到广泛的应用。一些不易制备抗体的生物大分子如核酸及多糖也常用亲和素生物大分子如核酸及多糖也常用亲和素生物素复合物生物素复合物(avidinn(avidinnbiotin complexbiotin complex，ABC)ABC)系统检测。如用生物素系统检测。如用生物素标记核酸探针，用于核酸杂交的分析。此外，小分子药物标记核酸探针，用于核酸杂交
38、的分析。此外，小分子药物地高辛地高辛(digoxin(digoxin)也可用于标记许多生物大分子，再用地高也可用于标记许多生物大分子，再用地高辛作半抗原免疫获得的相应抗体进行检测。用生物素、地辛作半抗原免疫获得的相应抗体进行检测。用生物素、地高辛等小分子化台物标记技术，在分子生物学实验中得到高辛等小分子化台物标记技术，在分子生物学实验中得到广泛的应用，统称为非放射性标记分析技术。广泛的应用，统称为非放射性标记分析技术。三、免疫定位分析三、免疫定位分析1 1、免疫荧光定位分析、免疫荧光定位分析 由于散射作用及生物材料所含天然荧光会影响荧光免疫分析由于散射作用及生物材料所含天然荧光会影响荧光免疫分
39、析(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay，FIA)FIA)的灵敏度和特异性。但不同发光颜色的荧的灵敏度和特异性。但不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学光化合物标记抗体用于免疫细胞化学(immuno(immunocytochemistrycytochemistry)和免疫组织化和免疫组织化学学(immunohistochemistry(immunohistochemistry)检测，对某些有生物功能的分子在细胞或组织中检测，对某些有生物功能的分子在细胞或组织中的表达和定位仍是非常有效的方法之一。的表达和定位仍是非常有效的方
40、法之一。常用的荧光色素常用的荧光色素(fluorochrome(fluorochrome)为异硫氰荧光素（为异硫氰荧光素（fluorescein fluorescein isothiocyanateisothiocyanate，FITC)FITC)和异硫氰四甲基罗丹明和异硫氰四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine(tetramethylrhodamine，TRITC)TRITC)等具有特殊的激发波长和发射波长等具有特殊的激发波长和发射波长(表表75)75)。荧光色素用双功能交联剂。荧光色素用双功能交联剂标记至抗体的标记至抗体的FcFc 段不影响其与细胞和组织中的抗原特异性结合。
41、组织切片或段不影响其与细胞和组织中的抗原特异性结合。组织切片或细胞样品处理既要使抗原结构保持完整并且充分暴露，同时也要保持细胞或组细胞样品处理既要使抗原结构保持完整并且充分暴露，同时也要保持细胞或组织结构的完整性。荧光色素可以标记特异性抗体，也可标记第二抗体，织结构的完整性。荧光色素可以标记特异性抗体，也可标记第二抗体，A A蛋白蛋白或亲和素。还可用不同的荧光色素标记不同的抗体，同时进行两种以上抗原分或亲和素。还可用不同的荧光色素标记不同的抗体，同时进行两种以上抗原分子的定位。荧光通过荧光显微镜来观察，组织切片和细胞上的荧光暴露在紫外子的定位。荧光通过荧光显微镜来观察，组织切片和细胞上的荧光暴
42、露在紫外光下，会迅速衰弱成淬灭，因此观察时要迅速，用荧光分析电脑软件进行记录光下，会迅速衰弱成淬灭，因此观察时要迅速，用荧光分析电脑软件进行记录分析可以得到更为准确而清晰的纳果。分析可以得到更为准确而清晰的纳果。用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞细胞亚群，在临床上具有重要意义。用荧光抗体标记的不同亚群，在临床上具有重要意义。用荧光抗体标记的不同淋巴细胞亚群，根据荧光强度及种类的差异用流式细胞淋巴细胞亚群，根据荧光强度及种类的差异用流式细胞仪可将不同细胞群分离，称为荧光激活细胞分拣器仪可将不同细胞群分离，称为荧光激活细
43、胞分拣器(fluorescence(fluorescenceactivated cell sorteractivated cell sorter，FACS)(FACS)(图图720)720)。用两种特异性荧光抗体。用两种特异性荧光抗体(抗抗CD4 CD4 和抗和抗CD8)CD8)标记淋标记淋巴细胞，则有巴细胞，则有4 4 种不同标记强度的细胞。细胞通过种不同标记强度的细胞。细胞通过FACS FACS 的喷嘴形成微滴，一个细胞形成一个微滴，当其通过激的喷嘴形成微滴，一个细胞形成一个微滴，当其通过激发光束时，产生的荧光信号被检测到，在记录的同时，发光束时，产生的荧光信号被检测到，在记录的同时，将信
44、号反馈至下方电极板，电极板根据荧光的强度和种将信号反馈至下方电极板，电极板根据荧光的强度和种类使微滴发生偏向，进入相应的收集管中。用类使微滴发生偏向，进入相应的收集管中。用FACS FACS 获得获得不同细胞亚群在淋巴细胞所占的比例及数量，并可收集不同细胞亚群在淋巴细胞所占的比例及数量，并可收集不同亚群的细胞。不同亚群的细胞。2 2酶标记免疫定位酶标记免疫定位酶标记免疫定位的方法及基本原理与酶标记免疫定位的方法及基本原理与dotELISAdotELISA相同，所用相同，所用的酶底物在反应后必须形成不溶于水的有色产物。酶标记免的酶底物在反应后必须形成不溶于水的有色产物。酶标记免疫定位主要用于免疫
45、组织化学进行组织和细胞内的抗原定位疫定位主要用于免疫组织化学进行组织和细胞内的抗原定位及免疫印迹分析以替代同位素标记的试验。及免疫印迹分析以替代同位素标记的试验。(1)(1)酶标免疫组织化学；免疫组织化学酶标免疫组织化学；免疫组织化学(immuuohistochemistry(immuuohistochemistry)的原理与的原理与dotdotELISAELISA相相同只是固相抗原为组织切片或细胞样品，用于标记抗体的酶同只是固相抗原为组织切片或细胞样品，用于标记抗体的酶和酶的底物见表和酶的底物见表7676。组织切片的制备尽可能保持组织细胞的形态结构及抗原分子在细组织切片的制备尽可能保持组织细
46、胞的形态结构及抗原分子在细胞中的天然定位及构象，固定过程有助于结构的保护和稳定，使蛋白胞中的天然定位及构象，固定过程有助于结构的保护和稳定，使蛋白质肽链上的活性基团发生交联并破坏氢键。常用的福尔马林质肽链上的活性基团发生交联并破坏氢键。常用的福尔马林(40(40甲醛甲醛)及其衍生物作固定剂，易损坏抗原结构，导致抗体的结合效率降低，及其衍生物作固定剂，易损坏抗原结构，导致抗体的结合效率降低，甚至失去结合作用。因此采用更温和的固定方法，同时用蛋白酶如胰甚至失去结合作用。因此采用更温和的固定方法，同时用蛋白酶如胰蛋白酶，胃蛋白酶及蛋白酶蛋白酶，胃蛋白酶及蛋白酶K K等酶解处理，破坏蛋白质的交联作用，
47、使等酶解处理，破坏蛋白质的交联作用，使组织的抗原决定簇充分暴露。石腊包理及一系列脱水过程也易使抗原组织的抗原决定簇充分暴露。石腊包理及一系列脱水过程也易使抗原结构破坏，改用环氧树酯包埋可以提高组织结构的分辨率，但仍对抗结构破坏，改用环氧树酯包埋可以提高组织结构的分辨率，但仍对抗原结构有破坏作用。组织样品不经过固定处理直接采用冰冻切片技术，原结构有破坏作用。组织样品不经过固定处理直接采用冰冻切片技术，对抗原结构的破坏最少，但易导致细胞形态改变及不能长期保存而受对抗原结构的破坏最少，但易导致细胞形态改变及不能长期保存而受到限制。此外植物细胞、种子、孢子及花粉等因紧密的细胞壁和其他到限制。此外植物细
48、胞、种子、孢子及花粉等因紧密的细胞壁和其他胞内结构，易干扰酶标记抗体的结合及显色产物的形成，须用特殊的胞内结构，易干扰酶标记抗体的结合及显色产物的形成，须用特殊的方法处理。而培养细胞可直接涂布在玻片上形成单层细胞，不需包埋方法处理。而培养细胞可直接涂布在玻片上形成单层细胞，不需包埋切片处理，直接用于免疫组织化学反应。切片处理，直接用于免疫组织化学反应。(2)免疫印迹：免疫印迹用于体外蛋白质抗原的分析。蛋白质经免疫印迹：免疫印迹用于体外蛋白质抗原的分析。蛋白质经SDSPAGE分离后，不同相对分子质量的蛋白质呈现不同迁移率，在聚丙烯酰分离后，不同相对分子质量的蛋白质呈现不同迁移率，在聚丙烯酰胺凝胶
49、胺凝胶(polyacrylamide gel)上形成不同的条带。这些蛋白质条带转移至上形成不同的条带。这些蛋白质条带转移至硝酸纤维膜硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane)上，其相对位置和含量与凝胶中保上，其相对位置和含量与凝胶中保持一致。结合在硝酸纤维膜上的蛋白质，类似于固相载体上吸附的抗原，持一致。结合在硝酸纤维膜上的蛋白质，类似于固相载体上吸附的抗原，可用酶标记的抗体进行与可用酶标记的抗体进行与dotELISA相同的显色反应，确定目的蛋白质的相同的显色反应，确定目的蛋白质的有无或相对分子质量的大小有无或相对分子质量的大小(图图721)。免疫印迹分析中标记抗体所用的酶。
50、免疫印迹分析中标记抗体所用的酶及相应底物与免疫组织化学相同，此外也可以用同位素标记或者非同位素及相应底物与免疫组织化学相同，此外也可以用同位素标记或者非同位素的的ABC系统等进行标记以提高方法的灵敏度。免疫印迹法常用于生物工程系统等进行标记以提高方法的灵敏度。免疫印迹法常用于生物工程中表达的一些微量蛋白质的检测。中表达的一些微量蛋白质的检测。3免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术 免疫电子显微镜免疫电子显微镜(immunoelectromicroscope，IEM)技术是电子显微镜技术与免疫反应相结合的技术是电子显微镜技术与免疫反应相结合的项技术，大大项技术，大大提高了电镜观察的特异性。形态相
