1、遗传学实验遗传学实验n人类外周血培养人类外周血培养n及染色体核型分析及染色体核型分析1一、一、实验目的：实验目的：1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。析。2二、实验原理：二、实验原理：1、植物血凝素的作用、植物血凝素的作用 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入中加入
2、植物血凝素植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。进行有丝分裂。3 2、秋水仙素的作用：、秋水仙素的作用：秋水仙素秋水仙素(colchicine)可以抑制细胞纺可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。同步的中期分裂细胞。使用秋水仙素处理会引起染色体在一定使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上
3、要合适。要合适。4 3、低渗的原理：、低渗的原理：徐道觉徐道觉(T.C.Hsu)等于等于1952年发现在固年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。统计，染色效果也明显提高。这种技术被广泛采用后，使人类染色体这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。分析技术得到了发展。54、核型和带型：、核型和带型：n核型核型(karyotype)：是指染色体组在有丝分裂中期的表型是指染色体组
4、在有丝分裂中期的表型,是染色体数目、大小、形态特征的总和。是染色体数目、大小、形态特征的总和。在对染色体进行测量计算的基础上在对染色体进行测量计算的基础上,进进行分组、排队、配对行分组、排队、配对,并进行形态分析的过并进行形态分析的过程叫程叫核型分析核型分析。将一个染色体组的全部染色体逐条按其将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为来的图称为核型模式图核型模式图，它代表一个物种的，它代表一个物种的核型模式。核型模式。6n带型带型（banding pattern）即染色体带型。借助细胞学的特殊处即染色体带型。借助细胞
5、学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。都有固定的分带模式，即称带型。常用的显带技术所显示的带有常用的显带技术所显示的带有Q带、带、G带、带、C带、带、R带、带、T带带等。就每一种分带技等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。恒定的。7三、实验用具及试剂：三、实验用具及试剂：1.实验仪器及用具：实验仪器及用具：恒温培养箱、离
6、心机、恒温水浴箱恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量、载玻片、烧杯、量筒。筒。.82.实验试剂：实验试剂：外周血淋巴细胞培养基外周血淋巴细胞培养基 2%碘酒碘酒 75%酒精酒精 20g/ml秋水仙素秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液溶液 甲醇甲醇 冰醋酸冰醋酸 Giemsa原液原液 1/15 mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 9四、实验步骤：四、实验步骤：1、采血：采血：将皮肤常
7、规消毒后静脉采血约将皮肤常规消毒后静脉采血约 0.5 ml。2、种血及培养：种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接每个培养瓶接28或或30滴（约滴（约0.5ml），轻轻摇匀后），轻轻摇匀后将培养瓶放在将培养瓶放在37温箱中培养温箱中培养72小时。培养过程小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。3、秋水仙素处理：秋水仙素处理：在终止培养前在终止培养前2-3小时，向培养小时，向培养瓶中加瓶中加 20g/ml的秋水仙素的秋水仙素3滴，轻轻摇匀后继续滴，轻轻摇匀后继续培养到培养到72小时。小时。104、制片：、制片：（
8、1）离心：离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。的刻度离心管内。2000转转/分，离心分，离心10分钟。分钟。（2）低渗：低渗：弃去上清液。加入弃去上清液。加入37预热的预热的0.075mol/L KCl低渗液低渗液8ml，用吸管轻轻吹打匀，放在，用吸管轻轻吹打匀，放在37恒温水浴中恒温水浴中40分分钟。钟。(此时配固定液：甲醇此时配固定液：甲醇225ml+冰醋酸冰醋酸75ml)2000转转/分，分，离心离心10分钟。分钟。（3）预固定：预固定：弃去上清液，在离心管中加入现配的预温的甲弃去上清液，在离心管中加入现配的预温的甲醇
9、醇-冰醋酸冰醋酸(3:1)固定液约固定液约1ml，轻轻混匀，轻轻混匀,室温固定室温固定5分钟。分钟。11（4）再次离心再次离心：2000转转/分离心分离心10分钟。分钟。（5）第一次固定第一次固定：弃上清液，加入固定液约：弃上清液，加入固定液约8ml，立即用吸，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定管吹打使之成细胞悬液，室温固定20分钟。分钟。2000转转/分离心分离心10分钟。分钟。（6）第二次固定第二次固定：同第一次固定。：同第一次固定。（7）弃上清液弃上清液，加入固定液，加入固定液0.5ml，用吸管吹打使均匀后制，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。用封口膜封口，成细胞悬液。用封口膜封口，4
10、 保存备用。保存备用。12 （8）滴片：滴片：在在30-40cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。上，注意动作应迅速，避免载片升温。（9）染色：染色：用用10%吉姆萨染液扣染吉姆萨染液扣染30分钟，染色结束后用清分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。（10）照相：照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核型核型)，再，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。（11）核型分析：核型分析：应用核型分析软件，进行染色体核型分析。应用核
11、型分析软件，进行染色体核型分析。1314核型分析仪及核型分析核型分析仪及核型分析15五、注意事项五、注意事项:1、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。2、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。否则引起膜破裂、染色体散失。3、离心前
12、配平，离心速度过高，细胞团不易打散；、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。反之，细胞易丢失。4、固定液应在使用前临时配制。、固定液应在使用前临时配制。5、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。16六、实验结果与分析：六、实验结果与分析：染色体核型分析：人类每个体细胞有染色体核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，条染色体，22对常染色体和一对性染色体，对常染色体和一对性染色体，男性为男性为46，XY；女性为；女性为46，XX。17A组（组（No.1 3）：是最大的一组染色体，它们的）：是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在
13、中部，为中部着丝粒染色着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色体；体；B组（组（N0.45）：为两对大的亚中部着丝粒染色）：为两对大的亚中部着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；体，它们有明显的长臂和短臂；C组（组（N0.612+X）：为中等大小的亚中部着丝）：为中等大小的亚中部着丝粒染色体，它们大小相差不多，粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介染色体大小介于期间，一般难以区分；于期间，一般难以区分；D组（组（N0.1315）：为中等大小的近端着丝粒染）：为中等大小的近端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于
14、短臂的末断，随体与一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；短臂之间的区域很少着色；人类染色体分组人类染色体分组18E组（组（N0.1618）：包括一对中着丝粒染色体）：包括一对中着丝粒染色体（16）和两对亚中着丝粒染色体（）和两对亚中着丝粒染色体（17、18）；）；F组（组（N0.1920）：为两对小的中部着丝粒染色）：为两对小的中部着丝粒染色体；体；G组（组（N0.2122+Y）：为最小的一组近端着丝粒）：为最小的一组近端着丝粒染色体，在染色体，在N0.2122的短臂上可见随体。的短臂上可见随体。Y染染色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。色体常呈现异固缩状态，
15、着色更深，可以识别。人类染色体核型分析结果人类染色体核型分析结果 19重要参数：重要参数：（1）染色体的相对长度）染色体的相对长度（2）臂比率）臂比率（3）着丝点指数）着丝点指数2021七、作业及思考题：七、作业及思考题：1、将分散良好的标本进行显微照相；、将分散良好的标本进行显微照相；2、观察人类染色体的形态、结构特点；、观察人类染色体的形态、结构特点；3、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；4、总结做好本实验的关键因素。、总结做好本实验的关键因素。22八、参考文献：八、参考文献：n医学遗传学基础与临床医学遗传学基础与临床.程在玉，伦玉兰程在玉，伦玉兰.山山东：青岛出版社，东：青岛出版社，1993.n遗传学实验教程遗传学实验教程.王建波，方呈祥等编王建波，方呈祥等编.武武汉：武汉出版社，汉：武汉出版社，2004.n外周血培养染色体失败的原因分析外周血培养染色体失败的原因分析.李庆，李庆，王秉仪，洪美玲等王秉仪，洪美玲等.解放军医学高等专科学解放军医学高等专科学校学报，校学报，1999(1)：72.23核型核型24带型带型25返回返回26 正正常常男男性性核核型型GABCDEF返回返回27个人观点供参考，欢迎讨论！
