1、焦焦 鹏鹏 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是是2020世纪世纪7070年代发展起来的一种以流式细胞仪为年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。原等，并可对其分类、收集的高新技术。流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术,同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而
2、大大提高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液,用计算机进行数据处理,从而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数,被誉为是细胞分析领域的“CT”。流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。流式细胞术流式细胞术 是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技术。术。利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生
3、物颗粒进行多参数、快速定量分析，同的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。成为当代最先进的细胞定量分析技术。6精选课件一流式细胞仪的原理一流式细胞仪的原理二流式细胞仪在生物医学中的应用二流式细胞仪在生物医学中的应用精选课件81973年世界第一台商用流式细胞仪年世界第一台商用流式细胞仪FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorte
4、r）1980年中国第一台流式细胞仪年中国第一台流式细胞仪FACS II北师大北师大生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域域流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 待测样品制成待测样品制成单个细胞的悬液单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）原等）染色染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（
5、鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照 在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。10精选课件 前向角散射，即前
6、向角散射，即FSC，与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时候，有时用候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。侧向角散射，即侧向角散射，即SSC，是指与激光束正交是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息信息 这两种信号同时被前向光电二极管和这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。前方向的光电倍增管接收。前向光散射信号在前向小角度进行
7、检测，这种信号基本上反映了细胞体积的向光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小。大小。荧光信号荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号荧光信号。这些荧光信号的强度代表这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面了所测细胞膜表面抗原抗原的强度或其的强度或其核内物质核内物质的浓度。的浓度。精选课件11精选课件1213精选课件精选课件14液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱精选课件15 另外，通过选择不同的单另外，通过选择不同的单克隆克隆
8、抗体及荧光染料，我们抗体及荧光染料，我们可以利用可以利用FCM同时测定一个细胞上的多种不同特征；同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。究。精选课件16应用范围应用范围凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。仪检测。前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发激发在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的在生物检测技
9、术中流式细胞仪是不可多得的一机多一机多用用的仪器。的仪器。精选课件17流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，而且还在不断增加。当然，细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征，将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter,FACS）精选课件18精选课件19流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞
10、结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的核的特异性抗原特异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体精选课件20 1流式细胞仪的分析速度：流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测一般流式细胞仪每秒检测3000 6000个细胞个细胞,大型机可达每秒几万个大型机可达每秒几万个细胞。细胞。2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：流式细胞仪的荧光检测灵敏
11、度：一般能测出单个细胞上一般能测出单个细胞上600个荧光分子个荧光分子,两个细胞间的荧光差两个细胞间的荧光差5%即可区分。即可区分。3前向角散射光（前向角散射光（FSC）检测灵敏度：）检测灵敏度：前向角散射光（前向角散射光（FSC）反映被测细胞的大小）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测一般流式细胞仪能够测量到量到0.2m.5m。精选课件2119精选课件23经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。FCM的光学系统
12、是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。长的荧光信号送入到不同的电子探测器。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片滤片。带阻或带通滤片带阻或带通滤片是有选择性地
13、使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用用525nm带通滤片只允许带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）异硫氰荧光素）发射的发射的525nm绿光通过。绿光通过。长长(短）波通过二向色性反射镜短）波通过二向色性反射镜只允许某一波长以只允许某一波长以上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性
14、反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。光学系统光学系统24精选课件FACSCalibur 光路图25精选课件我中心检测型流式细胞仪：BD FACSCalibur激光：488nm,633nm常用荧光标记：FL1：GFP;CFSE;FITC;Alexa Flouro 488FL2：PE;PIFL3：7-AAD;PE-Cy5;PerCP;PerCP-Cy5.5;PE-Cy5.5;PE-Cy7FL4：APC;Alexa Flouro 647一般检测项目：细胞凋亡检测细胞周期检测细胞内活性氧检测细胞表面标记检测细胞内因子检测精选课件26=激光激光 (
15、Laser)(Laser)=荧光素与荧光荧光素与荧光=FACSFACS检测的信号参数检测的信号参数精选课件27激光激光-=激光激光 (Laser)(Laser)是一种相干光源，它能提供是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照单一波长、单一方向、同步的稳定光照=单色性好，方向性好，亮度高，可提高分单色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力辨力=激光波长激光波长:488nm,635nm:488nm,635nm细胞微弱荧光快速分析的理想光源细胞微弱荧光快速分析的理想光源精选课件28FACSCalibur的激光系统的激光系统=FITC Fluorescein isothiocyanat
16、eFITC Fluorescein isothiocyanate=PE PhycoerythrinPE Phycoerythrin=PerCP Peridinin chorophyll proteinPerCP Peridinin chorophyll protein=APC AllophycocyaninAPC Allophycocyanin=PI Propidium iodidePI Propidium iodide600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser Lines=荧光素标记特异抗体荧光素标记特异抗体=荧
17、光素吸收激光能量，产生跃迁荧光素吸收激光能量，产生跃迁=回到基态，荧光素将吸收能量释放，转换回到基态，荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，释放较入射光波长更长为振动能和热能，释放较入射光波长更长的光量子的光量子=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强光信号越强=双激光，两点激发，实现双激光，两点激发，实现4 4色荧光分析色荧光分析=最大程度地减少荧光信号之间的最大程度地减少荧光信号之间的补偿补偿，提，提高检测灵敏度高检测灵敏度=双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，亦相应地扩大了仪器的应用领域亦相应地扩大了
18、仪器的应用领域精选课件33 当细胞携带两种荧光素如当细胞携带两种荧光素如PEPE和和FITC,FITC,受激光激发而发射受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，的重叠，FITCFITC探测器会探测到少量的探测器会探测
19、到少量的PEPE光谱，而光谱，而PEPE探测器探测器则检测到较多的则检测到较多的FITCFITC光谱。克服这种误差的最有效方法是光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路使用荧光补偿电路光谱重叠的校正光谱重叠的校正精选课件3435精选课件36精选课件=前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射（侧向角散射（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性Right Angle Light Detec
20、tor Cell ComplexityForward Light Detector Cell Surface AreaIncident Light Source精选课件38 FSC和和SSC两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。找出血小板和
21、红细胞等细胞群体。外周血细胞散射光双参数点图（裂解红细胞后）外周血细胞散射光双参数点图（裂解红细胞后）精选课件39 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。行分析或分选。此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 使用不同荧光素标记不同
22、单克隆抗体对细胞进行染色，做多色分析使用不同荧光素标记不同单克隆抗体对细胞进行染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量双色直接染色双色直接染色3940精选课件43液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室
23、上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱流式细胞仪的电子系统流式细胞仪的电子系统进行信号检测和分析进行信号检测和分析=当细胞携带荧光素标记物当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时通过激光照射区时,受到激发受到激发,产生不同波长的、代产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号表细胞内不同物质的荧光信号=经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。=从从PMT输出的电
24、信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。=数字信号传送到计算机，计算机把所测量到的各种信号进行处理、储存、数字信号传送到计算机，计算机把所测量到的各种信号进行处理、储存、作图、作图、统计分析统计分析,将分析结果显示将分析结果显示 在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。=MacintoshiMacintoshi系统，灵活多样的图形处理能力系统，灵活多样的图形处理能力 目前公认的最佳图像处理系统
25、,使流式细胞仪的功能发挥更加完美。强大的软件支持，灵活方便的数据处理功能强大的软件支持，灵活方便的数据处理功能=仪器自动校检软件仪器自动校检软件FACSCompFACSComp=主软件主软件CELLQuestCELLQuest=全面的自动化临床应用软件：全面的自动化临床应用软件：淋巴细胞自动检测软件淋巴细胞自动检测软件SimulSETSimulSET；MultiSETMultiSET干细胞自动检测软件干细胞自动检测软件ProCOUNTProCOUNTHLA-B27HLA-B27；ModFITModFIT；精选课件47 根据分析目的不同，对制备好的样本在流式细胞仪上根据分析目的不同，对制备好的样
26、本在流式细胞仪上测量其光散射和荧光强度。一般在测样本前先应用荧光标测量其光散射和荧光强度。一般在测样本前先应用荧光标准微球校准仪器，多色分析准微球校准仪器，多色分析 时还应进行颜色补偿，以避免时还应进行颜色补偿，以避免多色荧光间信号的相互干扰。多色荧光间信号的相互干扰。仪器校准后测量样本，每个细胞的光散射及荧光测量仪器校准后测量样本，每个细胞的光散射及荧光测量数据一般以列表或矩阵方数据一般以列表或矩阵方 式储存于计算机中，然后进行数式储存于计算机中，然后进行数据的显示、图象分析和结果统计处理，最终获得所分析细据的显示、图象分析和结果统计处理，最终获得所分析细胞的信息，也可在测定的同时进行结果分
27、析。胞的信息，也可在测定的同时进行结果分析。=数据存储数据存储:List Mode:List Mode精选课件49 数据的显示数据的显示 储存的数据文件虽然易于加工、处理、分析，但由于数据大，储存的数据文件虽然易于加工、处理、分析，但由于数据大，又缺乏直观性，不利于观察各参数及其相互的关系。因此，将又缺乏直观性，不利于观察各参数及其相互的关系。因此，将数据用图形显数据用图形显 示更直观，然后再进行统计分析，这是示更直观，然后再进行统计分析，这是FCM结结果分析中最常用的分析方法。果分析中最常用的分析方法。FCM数据显示通常有一维直方图、数据显示通常有一维直方图、二维点图、二维密度图、二维等高图
28、、假三维图等。二维点图、二维密度图、二维等高图、假三维图等。精选课件50 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。单参数直方图单参数直方图精选课件51单参数直方图单参数直方图细胞相对数量细胞相对数量荧光信号相对强度值（对数）图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）精选课件52图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 精选课件53n双参数双参数散点散点图：纵轴和横轴分别代
29、表被测图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。n双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。双参数散点图双参数散点图精选课件541.双参数散点图双参数散点图绿色荧光强度绿色荧光强度红色荧光强度红色荧光强度精选课件55双参数点图双参数点图精选课件562.二维等
30、高图二维等高图n由类似地图上的等高线组成，其本质也是由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。双参数直方图。n等高图上每一条连续曲线上具有相同的细等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即胞相对或绝对数，即“等高等高”。n曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞所代表的细胞数愈多。数愈多。n等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。精选课件57=等高图和密度图分析等高图和密度图分析二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。
31、曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。精选课件583.假三维等高图假三维等高图精选课件59三参数直方图三参数直方图三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-）。精选课件60流式细胞计是对细胞进行自动分析和分流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重示
32、悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预设的参量范围把指定量，并可以根据预设的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。的细胞亚群从中分选出来。样品分选精选课件61细胞分选的原理当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转
33、，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。精选课件62流式细胞分选的特点1.少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高（99%以上），速度快。目前，先进的流式细胞仪的分选速度可达25 000个细胞/秒以上，比传统的分选速度提高了很多倍，原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个，则需要耗费10小时以上，分选后细胞的活力会受到很大的影响。2.可以同时进行多个Marker分选，正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向
34、右偏转，即两路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。精选课件633.不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度（如细胞体积）或荧光（如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原）散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态，那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。4.如果只是偶尔做几次细胞分选的话，用流式分选还是比较划算的，只需要准备样品和抗体，交纳一定的仪器使用费即可，不需要购买配套的设备。=数据处理系统数据处理系统MacintoshiMacintoshi系统系统=Auto
35、loaderAutoloader自动进样系统：自动进样系统：4040管轮盘，软管轮盘，软件支持，简单易操作，真正实现无人操作件支持，简单易操作，真正实现无人操作=样本制备仪：样本制备仪：=免疫样本制备仪免疫样本制备仪=DNADNA样本制备仪样本制备仪精选课件66精选课件67精选课件68大型机大型机 FACS Vantage SE FACS Vantage SE=多激光多波长多激光多波长=八特征参数八特征参数=设计灵活设计灵活=高速分选高速分选=单细胞点对点分选单细胞点对点分选精选课件69台式机台式机 FACSCalibur FACSCalibur=双激光：双激光：488nm/635nm488n
36、m/635nm=四荧光六分析参数四荧光六分析参数=自动化程度高自动化程度高=分析速度快分析速度快=灵活的设计灵活的设计=细胞分选系统细胞分选系统细胞富集系统细胞富集系统70精选课件71精选课件最简化的样本处理过程，很好地防生物污染最简化的样本处理过程，很好地防生物污染完善的自动采样，自动分析出报告系统，防人为因素干扰完善的自动采样，自动分析出报告系统，防人为因素干扰严格完整地质控及对照系统，确保结果的准确性，可靠性严格完整地质控及对照系统，确保结果的准确性，可靠性完善的完善的CD4CD4，CD8CD8，CD3CD3绝对计数系统绝对计数系统专为专为HIVHIV监测设计的经济普及型流式细胞仪监测设
37、计的经济普及型流式细胞仪72精选课件73精选课件74精选课件双激光五色七参数分析双激光五色七参数分析自动补偿自动补偿Windows Windows 操作系统操作系统75精选课件76精选课件77精选课件流式细胞术样本来源流式细胞术样本来源 流式样品的制备中应注意的几个问题流式样品的制备中应注意的几个问题荧光染色的步骤荧光染色的步骤=细胞悬液：细胞悬液：=培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系=灌洗液、体腔积液灌洗液、体腔积液=分离分离PBMCPBMC、PRPPRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差定群体丢失，并可能引入某些误差=直
38、接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小用血量小=实体组织：实体组织：MedimachineMedimachine (Medimachine (Medimachine 系统是一套安全的系统是一套安全的,标准化的样本制备系统标准化的样本制备系统,可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离)=病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本石蜡包埋样本=针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本=鞘液、洗液、鞘液、洗液、PMAPMA等：清洁无颗粒杂质等：清洁无颗粒杂质80精选课件81精选课件82
39、精选课件83精选课件84精选课件85精选课件合适？合适？86精选课件精选课件87荧光染色荧光染色染色步骤染色步骤v表面染色：细胞表面抗原抗体反应表面染色：细胞表面抗原抗体反应v溶血：溶解红细胞溶血：溶解红细胞v破膜：细胞膜打孔，使胞内染料渗入破膜：细胞膜打孔，使胞内染料渗入v清洗：除去多余的染料及打孔剂清洗：除去多余的染料及打孔剂v胞内染色：细胞内抗原抗体反应胞内染色：细胞内抗原抗体反应v清洗：除去多余的染料清洗：除去多余的染料v固定：固定细胞，准备上机分析固定：固定细胞，准备上机分析88精选课件 样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞 悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计
40、学 分析继续培养 FCM提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通过荧光抗体和抗原检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原过荧光抗体和抗原检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD分子分子)、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要
41、的指导作用。的监测上起着重要的指导作用。根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能），行使免疫监控功能 根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为Th TTh T辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）Ts TTs T抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+
42、CD8+）Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE）Th/TsTh/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血 了解在不同情况下体内免疫功能状态了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病免疫系统疾病 免疫缺陷病，免疫缺陷病，AIDSAIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免
43、疫力检测肿瘤病人化疗后免疫力检测 样本使用样本使用EDTAEDTA抗凝全血，用血量抗凝全血，用血量600uL600uL 使用双色分析试剂使用双色分析试剂 使用使用SimulSETSimulSET自动软件，进行样本的获取和分析自动软件，进行样本的获取和分析 SimulSETSimulSET软件自动做质量检查，帮助发现样本运软件自动做质量检查，帮助发现样本运输、处理等过程中造成的错误输、处理等过程中造成的错误 医生报告医生报告T T、B B、NKNK淋巴细胞及淋巴细胞及ThTh、TsTs百分含量和百分含量和Th/TsTh/Ts比值，并报告参考值范围比值，并报告参考值范围=CD45/CD14(Leu
44、coGATE)CD45/CD14(LeucoGATE)：自动定义淋巴细：自动定义淋巴细胞的光散射门，并评估其有效性胞的光散射门，并评估其有效性=Isotype Control(Isotype Control(1 1/2a2a)：阴性对照，确：阴性对照，确定定FL1FL1和和FL2FL2的非特异性结合水平，界定阴性的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体和阳性细胞群体=CD3/CD19CD3/CD19：鉴别：鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞=CD3/CD4CD3/CD4：鉴别：鉴别T T辅助辅助/诱导淋巴细胞诱导淋巴细胞=CD3/CD8CD3/CD8：鉴别：鉴别T T抑制抑
45、制/毒性淋巴细胞毒性淋巴细胞=CD3/CD16+56CD3/CD16+56：鉴别：鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和NKNK细胞细胞精选课件97 CD45/CD14 LeucoGATECD45/CD14 LeucoGATE：Back-GatingBack-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并评，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性估门的有效性 Isotype Control(Isotype Control(1 1/2a2a)：阴性对照，确定阴性对照，确定FL1FL1和和FL2FL2的非特异性结合的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体水平，界定阴性和阳性细胞群体 CD3/CD19CD3/CD19
46、：鉴别鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞 CD3/CD4CD3/CD4：鉴别鉴别T T辅助辅助/诱导淋巴细胞诱导淋巴细胞=CD3/CD8CD3/CD8：=鉴别鉴别T T抑制抑制/毒性淋巴细胞毒性淋巴细胞 CD3/CD16+56CD3/CD16+56：鉴别鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和NKNK淋巴细淋巴细精选课件103BD SimulTEST IMK-Lymphocyte Kit(反反向设门法双色淋巴细向设门法双色淋巴细胞表型分析胞表型分析)健康中国人参考范围健康中国人参考范围（使用（使用SimunlSET自自动软件）动软件）项项 目目百分含量（百分含量（%淋淋巴细胞）巴细胞）
47、Total B lymphocyte(CD19+)5-18%NK cell(CD3-/CD16+56+)7-40%Total T lymphocyte(CD3+)50-84%T helper/inducer cell(CD3+/CD4+)27-51%T supressor/cytotoxic cell(CD3+/CD8+)15-44%Th/Ts0.71-2.78=T T淋巴细胞总数减少淋巴细胞总数减少=T T细胞亚群比例倒置，细胞亚群比例倒置，Th/Ts1.0Th/Ts1.0=ThTh细胞细胞(CD4+(CD4+细胞细胞)绝对计数绝对计数200200个个/ml/ml=TsTs细胞增高细胞增高=
48、NKNK细胞减少或活力下降细胞减少或活力下降=B B细胞正常细胞正常68%3.6%3.4%6.7%10%8.9%凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等。能够诱发细胞凋亡疫性疾病
49、、神经退行性变及局部损伤等。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、能够引起染色体损伤的药物、细胞自身的因素很多，如射线、能够引起染色体损伤的药物、细胞自身表达的一些受体分子等。表达的一些受体分子等。细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段形态学检查形态学检查LaddersLadders实验实验流式细胞仪检查流式细胞仪检查110精选课件n流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点仪固有的特点可以准确的进行凋亡细胞的计数。可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。111精选课
50、件线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。含量DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DN
