1、主要内容4.1 概述4.2 色谱分离的分类 4.3 生物工程中的色谱分离4.4 色谱分离的基本理论4.5 吸附色谱4.6 离子交换色谱4.7 分配色谱4.8 凝胶色谱4.9 高速逆流色谱4.10 径向色谱分离法4.11 连续环状色谱分离法4.1 概述色谱法的定义色谱法的发展简史色谱法的特点色谱法的定义n色谱法chromatographyn是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。凡是色谱分离都具有stationary phase和mobile phase。固定相是不动的，流动相对固定相作相对的
2、运动。被分离的组分与流动相和固定相有不同的作用力。这种作用力有吸附力，溶解力，离子交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用力的差别：K=Cs/Cm 分配系数的差异是色谱分离的根本原因。色谱法的发展史n色谱法的诞生n常见的分离方式如过滤、蒸馏、沉淀、结晶、离心、萃取、膜分离等在分离复杂的混合物时就显得力不从心了。n1903年，M.C.Tswett 进行了分离植物叶中各 种色素的实验。创立了 色谱法。It is very instructive to observe the adsorptionphenomena during filtration through a
3、powder.First a colourless,then a yellow（carotene）liquidflows out from the bottom of the funnel,while abright green ring forms at the top of the inulincolumn,below which a yellow ring soon appears.On subsequent washing of the inulin column withpure ligroin,both rings,the green and the yellow,are cons
4、iderably widened and move down thecolumn.M.S.TswettTr.Varshav.Obshch.Estestvoispyt.,Otd.Biol.,14（1903）20n然而，在20多年时间里，他的新分离方法并没有受到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化学家R.Willsttter对色谱法的排斥和不信任。nWillsttter（1915年获诺贝尔化学奖获得者）1913年在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是一种“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作，在吸附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写道：“色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎不适合于制备
5、目的”nWillsttter的观点，即过分强调制备工作，也反映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的技术是超越其时代的。具有一定的孔径分布范围；也可用交链聚丙烯酰胺作材料制得带巯芳基的活性色谱填料。20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未得到较广泛的应用。54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 neff=5.1/16 3/8 1/16流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。聚丙烯酰胺系（Bio-Gel P）这四种过程是涡流扩散、纵向分子扩散、流动相中传质和固定相中传质。column,below which a yellow ring soon appea
6、rs.即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。色谱过程中的扩散和传质2sa=2kLu/（1+k）2Kd）色谱法chromatography组分从流动相主体扩散到流动相与固定相的界面，以便发生相转移，妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力。n =5.柱由完全相同的不连续的体积单元组成，每一个体积单元犹如精馏塔中的一块塔板，而它在柱内又是不存在的，故称理论塔板。HAP的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面，分别起阴、阳离子交换作用。Sepharose CL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高
7、。琼脂糖凝胶Sepharose是另一种较常使用的凝胶过滤介质，机械强度较低。（p+q）4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4n1930年12月，奥地利22岁研究生E.Lederer到海得堡R.Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察，从文献中了解到茨维特的色谱技术。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色柱中，成功地分离了-、-、-胡萝卜素，并发表了三篇论文，公布了他们的研究成果。这标志着色谱法的复兴。nKarrer在1937年，Kuhn在1938年，Ruzicka在1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色谱法得到普遍的公认，成为最有效的分离提纯手段。n
8、色谱法的发展n1931年，Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、-、-胡萝卜素后才引起重视。Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的，称为吸咐色谱adsorption chromatography。n1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色谱法。n1941年A.J.P.Martin和R.L.M.Synge发明了分配色谱法（partition chromatography）。1952年获诺贝尔化学奖。Archer John Porter Martin Richard Laurence Milling
9、ton Synge n1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性。n1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱法gas-liquid chromatography。n1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-tubular column chromatography，即毛细管柱气相色谱法capillary column chromatography。n1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论。n1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。琼脂糖系（Sepharose、Bio-Gel
10、 A）表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。3 生物工程中的色谱分离对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。组分到达两相界面后，就要扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回两相界面。First a colourless,then a yellow（carotene）liquid羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为Ca10(PO4)6(OH)2。根据组分的物理化学特性，例如紫外吸收、荧光性、电导率、旋光性以及可见光光密度等，进行在线检测。
11、8倍，处理量为轴向柱的3倍。妨碍这一过程的阻力称为固定相传质阻力。它还排除了一个极其重要的参数流动相速度，并忽略了两相体积的大小。C传质阻力相为弯曲因子，亦称阻碍因子，它反映固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况，一般小于1；2sa=2kLu/（1+k）2Kd）在制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的径向色谱柱（radial flow chromatographic column，RFCC）。Synge发明了分配色谱法（partition chromatography）。对于生物大分子而言，分离的好坏往往与理论塔板数没有明显的关系。涡流扩散 edd
12、y diffusion空隙体积（void volume）按固定相及流动相的状态分类n1944年R.Consden、A.H.Gorden和Martin等发展了纸色谱。n1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得以实际应用，1956年E.Stahl对TLC的标准化、规范化及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。n1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法（gel chromatography）。n1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱法
13、（affinity chromatography）。n20世纪60年代初，Giddings将气-液色谱理论用于液-液色谱，同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，于60年代末出现了高效液相色谱（HPLC）。n20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未得到较广泛的应用。n20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE），在90年代得到广泛的发展和应用。n同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代后期受到重视。色谱法的特点n分离效率高n可选操作参数多n应用范围广n高灵敏度的
14、在线检测快速n分离与过程自动化操作 4.2 色谱分离的分类 n按分离机理不同分类 n按固定相及流动相的状态分类n按固定相形状分类 n其他分类方法 例如，鼠肝细胞色素C氧化酶可被Octyl Sepharose完全吸附，而用Decyl Sepharose为吸附剂时，吸附作用降低；是将柱后流出的液体，定时定量分别收集的仪器。迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。分配系数在所有塔板上都为常数，与组分浓度无关即相当于线性等温线的情况。1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤除去。疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正
15、比，一般配基修饰密度在1040 mol/cm3之间。11 连续环状色谱分离法速率理论 Rate TheoryDs为组分在固定相中扩散系数。应用色谱技术范围的不同First a colourless,then a yellow（carotene）liquid气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得以实际应用，1956年E.拟移动床色谱（simulated moving bed chromatography）。离子对色谱ion-
16、pair chromatography。由涡流扩散引起的展宽程度可表示为：溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100；按形状可分成球形和无定形两类；按分离机理不同分类n吸附色谱nAdsorption chromatography，AC是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。n吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条件下也可以
17、互相转化。n吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。n在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，如疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、金属螯合作用色谱（metal chelation chromatography，MCC）和共价作用色谱（covalent interaction chromatography，CIC）等，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都有比较明确的作用机理，即疏水作用、螯合作用和共价作用。n离子交换色谱n离子交换色谱（ion exchange chroma
18、tography，IEC）是基于离子交换原理进行的色谱分离。广泛用于生物大分子的分离纯化中。n亲和色谱n亲和色谱（affinity chromatography，AFC）是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的过程。n亲和作用是特殊的吸附作用。n分配色谱nDistribution chromatography，DC又称为液液色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。n分配色谱可分为正相色谱（normal phase chromatography，NPC）和反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）
19、。n离子对色谱ion-pair chromatography。n凝胶色谱n凝胶色谱（gel chromatography，GC）以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱（molecular sieve chromatography，MSC）；空间排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。n凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）。n电色谱n电色谱（electrochr
20、omatography）是电泳和液相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具有的选择性，使它不仅能分离带电物质。也能分离中性化合物。54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 Heff=L/NeffIt is very instructive to observe the adsorption迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。Sepharose CL是
21、利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。=1/16+1/4+3/8+1/4+1/16（p+q）N20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未得到较广泛的应用。凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得以实际应用，1956年E.琼脂糖系（Sepharose、Bio-Ge
22、l A）影响2s 因素有：df、Ds、u、L、k由流动相传质阻力所引起的展宽程度可表示为：在中性pH环境下酸性蛋白质（pI7）主要吸附于C点，碱性蛋白质（pI7）主要吸附于P点。HIC可作为IEC的补充工具。C传质阻力相为填充不规则因子，它决定于固定相颗粒的直径dp、粒度范围和填充情况；凝胶粒径多用筛目或微米表示。血清蛋白质的结果。形成螺旋形谱带。凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）。按固定相及流动相的状态分类n气相色谱GCn气相色谱（gas c
23、hromatography，GC）仅限于能够气化的物质，且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。n液相色谱LCn液相色谱（liquid phase chromatography，LPC）可分为液液色谱LLC、液固色谱LSC。n超临界流体色谱n超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）是20世纪80年代中期发展起来的一种新的色谱分离技术，其流动相为超临界流体。按固定相形状分类n柱色谱（column chromatography）n平面色谱（planar chromatography）n纸上层析（paper chromatog
24、raphy）n薄层色谱（thin layer chromatography）其他分类方法n按使用领域不同对色谱仪的分类1.分析用色谱仪n又可分为实验室用色谱仪、在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪和便携式色谱仪。2.制备用色谱仪n又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。n根据操作压力不同进行分类n可分为低压色谱分离（0.5 MPa）、中压色谱分离（0.55 MPa）和高压色谱分离（550 MPa）。n低压色谱分离的装置比较简单，操作费用低，但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使
25、生物活性物质活性降低。n高压色谱分离技术的特点是，流动相流动速率高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用下有些生物物质有变性的可能。n根据展开方式进行分类n根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为洗脱展开（elution development）、迎头分析（frontal analysis）和顶替展开（displacement development）三种。n洗脱展开（elution chromatography）。n迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。n迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间分
26、配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的（分配系数最小）的组分能以纯粹的状态得到部分回收，之后的流出液均为双组分或双组分以上的混合物。n顶替展开与洗脱展开相似，唯一不同之处是：顶替展开所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质，这种物质称为顶替剂（displacer）。顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替（洗脱）出来。顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。n根据流动方式进行分类n一般色谱操作中流动相从固定床的一端输入，沿轴向流向另一端，属于轴向流色谱（axis flow chromatography）。n径向流色谱（radia
27、l flow chromatography）是在柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中心管流出。n连续环状色谱（continuous annular chromatography）。n拟移动床色谱（simulated moving bed chromatography）。4.3 生物工程中的色谱分离 n色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。在基因工程产品中，色谱分离占有核心地位。n色谱分离的规模 n色谱分离方法的选择 n分析色谱与工业色谱的比较 色谱分离的规模n与一般分离技术相比，色谱分离的规模是相当小的。根据分离时一次进样量的
28、多少，色谱分离的规模可分为如下4类：n色谱分析：10 mgn半制备（或称中等规模制备）：1050 mgn制备（或称样品制备）：0.110 gn工业生产：20 g色谱分离方法的选择 n应用色谱分离方法制备和生产生物体组成成分，包括各种初级代谢产物、次级代谢产物以及各种生物大分子，使用色谱技术来分离纯化这些物质时常根据如下几个方面来选择不同的色谱分离方法。目的产物的分子结构、物理化学特性、及分子量的大小；主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质的成分与含量；目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。分析色谱与工业色谱的比较n应用色谱技术范围的不同n分析色谱的流动相包括气相和液相
29、，固定相形状包括柱、纸和薄板，而制备和工业色谱主要是采用以液相为流动相的柱色谱。n操作上的不同n在分析色谱中，进样量愈小愈好，因此出现了当今的微型毛细管柱色谱；在制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的径向色谱柱（radial flow chromatographic column，RFCC）。n色谱分离理论上的不同1.理论塔板数的不同n对于生物大分子而言，分离的好坏往往与理论塔板数没有明显的关系。2.分配系数的不同n 线性色谱与非线性色谱3.样品保留值与峰高的不同n制备色谱和工业色谱中，不能根据保留值定性，色谱的峰高也不能作为制备色谱和工业色谱定量分析的
30、指标。4.4 色谱分离的基本理论塔板理论速率理论 吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用。超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）是20世纪80年代中期发展起来的一种新的色谱分离技术，其流动相为超临界流体。按使用领域不同对色谱仪的分类因此RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。短链烷基（C3C8）20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE），在90年代得到广泛的发展和应用。反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，
31、通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。进料位置开始在环状床层内在制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的径向色谱柱（radial flow chromatographic column，RFCC）。一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。数量级的物质的分离df为固定液的平均厚度。df为固定液的平均厚度。离子对色谱ion-pair chromatography。有滴数式、容量式、质量式等若干种。常在pH值为68时蛋白质可被吸附，洗脱一般降低pH值、增加离子强度或在缓冲液中加入螯
32、合剂如EDTA等方法进行。TSK gel Toyopearl HW6），QAE（季铵乙基）。按固定相及流动相的状态分类4.4.1 塔板理论n塔板理论Plate Theory就是把分配色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，挥发度大的组分最先从“塔顶”（即柱出口）逸出，由于流动相连续地进入柱内，为了便于研究组分在两相间的分配行为。n塔板理论的基本假设：柱由完全相同的不连续的体积单元组成，每一个体积单元犹如精馏塔中的一块塔板，而它在柱内又是不存在的，故称理论塔板。每一块塔板的一部分空间为固定相所占据，另一部分空间为流动相所占据。这后一部分空间称为塔板体积（Vm）。
33、流动相从柱入口以一个个Vm 体积，脉冲式地加入。组分在每块塔板上的两相间瞬时达到平衡。分配系数在所有塔板上都为常数，与组分浓度无关即相当于线性等温线的情况。忽略塔板间的纵向分子扩散。n流出曲线 经N次平衡后，流动相中的组分分数q与在固定相组分分数p符合二项式分布：（p+q）N 上例中K=1，p=q=1/2，展开为：（p+q）4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4 =1/16+1/4+3/8+1/4+1/16 若K=2，p=0.667，q=0.333，则 （p+q）4=0.198+0.395+0.296+0.099+0.012 当N50时，流出曲线对称呈正态分布。进流动相进流动相平衡平衡
34、 K=11/4 2/4 1/41/8 3/8 3/8 1/81/21/16 3/8 1/16n柱效 n =5.54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 neff=5.54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 Heff=L/Neffn分配色谱与精馏的差别二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，目前尚未大规模的应用。分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形状包括柱、纸和薄板，而制备和工业色谱主要是采用以液相为流动相的柱色谱。例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD，即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为V0。Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。TSK
35、gel PW商品化的凝胶过滤介质种类54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 Heff=L/Neff5 MPa）、中压色谱分离（0.根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为洗脱展开（elution development）、迎头分析（frontal analysis）和顶替展开（displacement development）三种。也可用交链聚丙烯酰胺作材料制得带巯芳基的活性色谱填料。在中性pH环境下酸性蛋白质（pI7）主要吸附于C点，碱性蛋白质（pI7）主要吸附于P点。凝胶粒径多用筛目或微米表示。在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。4 色谱分离的基本理论因此，茨维特的技术是超越
36、其时代的。由涡流扩散引起的展宽程度可表示为：按形状可分成球形和无定形两类；在色谱分析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用力的差别：Millington Synge机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 Heff=L/Neff由流动相传质阻力所引起的展宽程度可表示为：疏水性相互作用机理比较复杂2sa=2kLu/（1+k）2Kd）每一块塔板的一部分空间为固定相所占据，另一部分空间为流动相所占据。由流动相传质阻力所引起的展宽程度可表示为：影响展宽的因素有：dp、u、Dm、L洗脱时，若使用还原力
37、逐次增加的巯基化合物或者逐渐增加巯基化合物的浓度，都可以增加蛋白质的洗脱分辨率，提高选择性。商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂。迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，目前尚未大规模的应用。吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用。在制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的径向色谱柱（radial flow chromatographic column，RFCC）。在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易
38、于洗脱。1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤除去。同一组分在氢气中的扩散系数要大于在氮气中的扩散系数，因此用氢气作流动相对，纵向分子扩散更严重。凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）。为填充不规则因子，它决定于固定相颗粒的直径dp、粒度范围和填充情况；速率理论 Rate Theoryn塔板理论满意地解释了色谱流出曲线呈高斯分布；论证了组分的保留值与分配系数间的关系；并能成功地用于塔板数的计算。n塔板理论的局限性n塔板理论作了五个不符合实际的假设。它还排除了
39、一个极其重要的参数流动相速度，并忽略了两相体积的大小。由于排除了流动相速度这一参数，因而不能解释在不同流动相速度时的柱效不同的原因。从本质上说，塔板理论的缺点在于忽视了组分分子在两相中扩散和传质的动力学过程。n色谱过程中的扩散和传质n对速率理论作出全面解释的是荷兰化学家Van Deemter等，以后又由美国化学家J.Calvin Giddings作了进一步的改进。n当组分的谱带向柱出口迁移时，在非理想线性色谱状态下必然要展宽。n在柱内有四种受动力学控制的过程，使谱带偏离理想状态而展宽。n这四种过程是涡流扩散、纵向分子扩散、流动相中传质和固定相中传质。n涡流扩散 eddy diffusionn当
40、组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒的障碍，不断改变方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。n由涡流扩散引起的展宽程度可表示为：2e=2dpL 为填充不规则因子，它决定于固定相颗粒的直径dp、粒度范围和填充情况；L为柱长。n纵向分子扩散 longitudinal diffusion 纵向分子扩散指沿x轴方向的扩散，它是由浓度梯度造成的。由纵向分子扩散引起的展宽程度可表示为：2l=2DmL/u 为弯曲因子，亦称阻碍因子，它反映固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况，一般小于1；u为流动相线速；Dm为组分在流动相中的扩散系数。Dm1/
41、M。同一组分在氢气中的扩散系数要大于在氮气中的扩散系数，因此用氢气作流动相对，纵向分子扩散更严重。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色柱中，成功地分离了-、-、-胡萝卜素，并发表了三篇论文，公布了他们的研究成果。1931年，Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、-、-胡萝卜素后才引起重视。二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，目前尚未大规模的应用。HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法。2s=qkdf2Lu/（1+k）2Ds）Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的，称为吸咐色谱adsorption chrom
42、atography。3 生物工程中的色谱分离即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。1986年后出现了高效化的商品球形HAP吸附剂，如Bio-Rad、Sigma、高研（Koken）、旭光学（Asashi Optical）、东压燃料工业（Toatsu）等公司均有产品出售。分级范围（fractionation range）15molL NaCl（pH7.1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得以实际应用，1956年E.20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未
43、得到较广泛的应用。具有一定的孔径分布范围；由固定相中传质阻力引起的谱带展宽程度可表示为：B纵向扩散相表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。一方面蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，即离子强度的微小改变，就会引起分配系数的很大变化；当组分的谱带向柱出口迁移时，在非理想线性色谱状态下必然要展宽。常用的疏水性配基主要有：色谱法chromatographyn流动相中传质阻力 组分从流动相主体扩散到流动相与固定相的界面，以便发生相转移，妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力。由流动相传质阻力所引起的展宽程
44、度可表示为：2m=dp2Lu/Dm 是由柱填充性质决定的因子，与固定相性质及构型有关。dp为固定相颗粒的平均直径。影响展宽的因素有：dp、u、Dm、Ln固定相中传质阻力 组分到达两相界面后，就要扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回两相界面。妨碍这一过程的阻力称为固定相传质阻力。由固定相中传质阻力引起的谱带展宽程度可表示为：2s=qkdf2Lu/（1+k）2Ds）q 是与固定相性质、构型有关的因子，对均匀液膜，q为2/3；k为分配比。df为固定液的平均厚度。Ds为组分在固定相中扩散系数。影响2s 因素有：df、Ds、u、L、k 对于吸附色谱，其分配平衡受吸附-解吸动力学速率控制，固定相中传质
45、阻力引起的谱带展宽程度可表示为：2sa=2kLu/（1+k）2Kd）Kd为吸附速率常数。n速率理论方程式 H=2/L=2e+2l+2m+2s=2dp+2Dm/u+dp2u/Dm+qkdf2u/(1+k)2Ds)H=A+B/u+Cu 这里A涡流扩散相 B纵向扩散相 C传质阻力相4.5 吸附色谱n吸附色谱的一般操作n羟基磷灰石色谱n疏水作用色谱n金属螯合色谱n共价作用色谱n吸附剂（固定相）对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的。n无机基质吸附色谱（多种作用力）n疏水作用吸附色谱（疏水作用）n共价作用吸附色谱（共价键）n金属螯合作用吸附色谱（螯合作用）n离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱。吸附
46、色谱的一般操作n吸附剂的选择n按化合物的种类可分成无机基质色谱填料和有机基质色谱填料两大类；n按形状可分成球形和无定形两类；n按硬度可分成硬质色谱填料、半硬质疑胶色谱填料及一些如琼脂糖的生物软胶；n按结构可分成表面多孔薄壳色谱填料和全多孔色谱填料两类。n装置n一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分构成。n流动相供给部分n一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。n检测器n根据组分的物理化学特性，例如紫外吸收、荧光性、电导率、旋光性以及可见光光密度等，进行在线检测。n流分收集器n是将柱后流出的液体，定时定量分别收集的仪器。有滴数式、容量式、质量式等若干种。组分从流动相主体
47、扩散到流动相与固定相的界面，以便发生相转移，妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力。与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；用高效GFC分离骨髓对于吸附色谱，其分配平衡受吸附-解吸动力学速率控制，固定相中传质阻力引起的谱带展宽程度可表示为：Sepharose CL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。纵向分子扩散指沿x轴方向的扩散，它是由浓度梯度造成的。2s=qkdf2Lu/（1+k）2Ds）First a colourless,then a yellow（carotene）liquid应用色谱技术范围的不同HIC可作为IEC的补充工具。flows o
48、ut from the bottom of the funnel,while a在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法。4 色谱分离的基本理论按固定相及流动相的状态分类由流动相传质阻力所引起的展宽程度可表示为：质量从几百到，106凝胶粒径多用筛目或微米表示。若K=2，p=0.在中性pH环境下酸性蛋白质（pI7）主要吸附于C点，碱性蛋白质（pI7）主要吸附于P点。1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱法（affinity chromatography）。当组分的谱带向柱出口迁移时，在非理想线
49、性色谱状态下必然要展宽。羟基磷灰石色谱 n羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为Ca10(PO4)6(OH)2。nHAP的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面，分别起阴、阳离子交换作用。nA W K Tiselius et al于1956年提出。n1956年Tiselius型羟基磷灰石用于蛋白质分离n1986年后出现了高效化的商品球形HAP吸附剂，如Bio-Rad、Sigma、高研（Koken）、旭光学（Asashi Optical）、东压燃料工业（Toatsu）等公司均有产品出售。n由于HAP晶体表面结
50、构特别，吸附机理特殊，可用于识别DNA及RNA的单链和双链。n可分离IEC和HIC难于分离的蛋白质体系。nHAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法。n在中性pH环境下酸性蛋白质（pI7）主要吸附于C点，碱性蛋白质（pI7）主要吸附于P点。利用磷酸盐缓冲液（K2HPO4KH2PO4）为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在C点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质，而K在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。nHAP吸附剂价格便宜，远低于离子交换剂，适用于大规模分离纯化过程，已成为单克隆抗体的主要纯化手段。n如人肿瘤坏死因子 （human tumour necrosis factor，hTN
