1、1不明原因肺炎病例的不明原因肺炎病例的实验室诊断实验室诊断广州市第八人民医院检验科广州市第八人民医院检验科卢业成卢业成2主主 要要 内内 容容不明原因肺炎的病原学不明原因肺炎的病原学实验室生物安全实验室生物安全标本的采集、包装、运送及保存标本的采集、包装、运送及保存不明原因肺炎的实验室检测不明原因肺炎的实验室检测注意事项注意事项3一、不明原因肺炎的病原学一、不明原因肺炎的病原学肺炎肺炎细菌性肺炎：细菌性肺炎：肺炎链球菌、肺炎链球菌、克雷伯菌、克雷伯菌、葡萄球菌、葡萄球菌、Atypical pneumonias支原体肺炎支原体肺炎衣原体肺炎衣原体肺炎军团菌肺炎军团菌肺炎 非感染性肺炎：非感染性肺
2、炎：过敏性肺炎、肺血管炎、过敏性肺炎、肺血管炎、急性间质性肺炎急性间质性肺炎有流感症状的疾病：有流感症状的疾病：普通感冒、流感、普通感冒、流感、艾滋病、免疫抑制合并艾滋病、免疫抑制合并肺部感染肺部感染其他传染性肺炎：其他传染性肺炎：炭疽、肺鼠疫炭疽、肺鼠疫不明原因肺炎不明原因肺炎SARS高致病性人禽流感高致病性人禽流感4SARS的病原学的病原学SARS-SARS-CoVCoV属冠状病毒科冠状病毒属属冠状病毒科冠状病毒属的有包膜病毒。的有包膜病毒。病毒基因组为单股正链病毒基因组为单股正链RNARNA，30,00030,000个核苷酸组成；与经典冠状病毒仅个核苷酸组成；与经典冠状病毒仅有约有约60
3、%60%同源性，但其组织形式与其同源性，但其组织形式与其他冠状病毒相似。他冠状病毒相似。双层脂膜，外膜蛋白包括糖蛋白双层脂膜，外膜蛋白包括糖蛋白S S、M M和小衣壳和小衣壳E E蛋白。蛋白。M M糖蛋白仅有短的糖蛋白仅有短的氨基末端结构域暴露于包膜外面；氨基末端结构域暴露于包膜外面；长而弯曲的羧基末端与单一分子的长而弯曲的羧基末端与单一分子的基因组基因组RNARNA及多分子的碱性及多分子的碱性N N蛋白组蛋白组成螺旋状核衣壳结构。成螺旋状核衣壳结构。5SARS-SARS-CoVCoV的生物学特性：的生物学特性：室温下在尿液里至少可存活室温下在尿液里至少可存活1010天，在腹泻患者的痰液和粪天
4、，在腹泻患者的痰液和粪便里能存活便里能存活5 5天以上，在血液中可存活约天以上，在血液中可存活约1515天，在塑料天，在塑料/玻玻璃璃/马赛克马赛克/金属金属/布料布料/复印纸等物体表面可存活复印纸等物体表面可存活2 23 3天。天。病毒对温度敏感，随温度升高抵抗力下降，病毒对温度敏感，随温度升高抵抗力下降，3737可存活可存活4 4天，天，5656加热加热90min90min、7575加热加热30min30min能够灭活病毒。紫外能够灭活病毒。紫外线照射线照射60min60min可杀死病毒。可杀死病毒。病毒对有机溶剂敏感，乙醚病毒对有机溶剂敏感，乙醚4 4 条件下作用条件下作用2424小时可
5、完全小时可完全灭活病毒，灭活病毒，75%75%乙醇作用乙醇作用5 5分钟可使病毒失去活力，含氯的分钟可使病毒失去活力，含氯的消毒剂作用消毒剂作用5 5分钟可以灭活病毒。分钟可以灭活病毒。6*属正粘病毒科甲型流感病毒属。呈多形性，有囊膜。属正粘病毒科甲型流感病毒属。呈多形性，有囊膜。*病毒基因组为分节段单股负链病毒基因组为分节段单股负链RNARNA。*能感染人的亚型有能感染人的亚型有H5N1H5N1、H9N2H9N2、H7N7H7N7、H7N2H7N2、H7N3H7N3等，等，其中感染其中感染H5N1H5N1的患者病情重，病死率高。的患者病情重，病死率高。禽流感病毒结构示意图禽流感病毒结构示意图
6、 7禽流感病毒的生物学特性：禽流感病毒的生物学特性：对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。常用消毒剂易将其对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。常用消毒剂易将其灭活，如氧化剂、稀酸、卤素化合物（漂白粉和碘剂）等灭活，如氧化剂、稀酸、卤素化合物（漂白粉和碘剂）等能迅速破坏其活性。能迅速破坏其活性。对热比较敏感，但对低温抵抗力较强，对热比较敏感，但对低温抵抗力较强，65 30min65 30min或煮沸或煮沸2min2min可灭活。在较低温粪便中可存活可灭活。在较低温粪便中可存活1 1周，在周，在44水中可存水中可存活活1 1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0pH4
7、.0也具有一定也具有一定存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1 1年以上。年以上。裸露的病毒在直射阳光下裸露的病毒在直射阳光下404048h48h即可灭活，如果用紫外线即可灭活，如果用紫外线直接照射，可迅速破坏其活性。直接照射，可迅速破坏其活性。8不明原因肺炎检测实验室的设置不明原因肺炎检测实验室的设置 按传染性非典型肺炎实验室检测工作程按传染性非典型肺炎实验室检测工作程序及的要求建立国家、省和地（市）级临床序及的要求建立国家、省和地（市）级临床标本三级实验室检测网络体系。标本三级实验室检测网络体系。卫生部在中国卫生部在中国CDCCDC病毒病预防控制
8、所病毒病预防控制所(国家流感中心国家流感中心)和和传染病预防控制所设立国家级检测实验室。传染病预防控制所设立国家级检测实验室。广东省卫生厅确认省广东省卫生厅确认省CDCCDC（流感实验室流感实验室）为我省中心实为我省中心实验室，广州市验室，广州市CDCCDC为平行中心实验室。为平行中心实验室。并建立覆盖全省的初筛实验室。并建立覆盖全省的初筛实验室。9二、实验室生物安全二、实验室生物安全 为加强对传染性非典型肺炎实验室的管理工作，避为加强对传染性非典型肺炎实验室的管理工作，避免发生实验室内感染和对环境的污染，避免由于实验室免发生实验室内感染和对环境的污染，避免由于实验室操作不当造成操作不当造成S
9、ARSSARS的传播，保障实验室人员的安全和健的传播，保障实验室人员的安全和健康，卫生部办公厅于康，卫生部办公厅于20032003年年6 6月月1616日印发日印发传染性非典传染性非典型肺炎实验室生物安全操作规范型肺炎实验室生物安全操作规范。所有参与。所有参与SARSSARS防治防治和研究的实验室和实验室工作人员都必须遵守。同时废和研究的实验室和实验室工作人员都必须遵守。同时废止止20032003年年4 4月月2929日印发的日印发的传染性非典型肺炎实验室生传染性非典型肺炎实验室生物安全操作指南物安全操作指南。10二、实验室生物安全二、实验室生物安全 按照传染性非典型肺炎实验室生物安全操按照传
10、染性非典型肺炎实验室生物安全操作规范的要求所有实验室人员应采取规范的生作规范的要求所有实验室人员应采取规范的生物安全防护，并经过相应的专业技术培训。物安全防护，并经过相应的专业技术培训。凡操作活病毒的试验必须在生物安全凡操作活病毒的试验必须在生物安全IIIIII级（级（BSL-3BSL-3）或或以上级的实验室中进行。以上级的实验室中进行。其余的临床试验可在生物安全其余的临床试验可在生物安全IIII级级+（BSL-2BSL-2+）实验室或实验室或全排式生物安全柜中进行。全排式生物安全柜中进行。从事患者样品常规检验应使用专用实验室和仪器。从事患者样品常规检验应使用专用实验室和仪器。11二、实验室生
11、物安全二、实验室生物安全 下列操作必须在生物安全下列操作必须在生物安全3 3级级(BSL3)(BSL3)或以或以上级实验室中进行：上级实验室中进行：用细胞培养的方法分离病毒；用细胞培养的方法分离病毒；收集或浓缩病毒或其培养产物；收集或浓缩病毒或其培养产物；用活病毒或病毒的全基因接种动物。用活病毒或病毒的全基因接种动物。12二、实验室生物安全二、实验室生物安全 下列操作必须在生物安全下列操作必须在生物安全2 2级级(BSL2)(BSL2)或以上级实或以上级实验室，或全排式生物安全柜中进行：验室，或全排式生物安全柜中进行：咽拭子咽拭子/含漱液含漱液/痰液痰液/尿尿/粪便粪便/血清和血液等样品的诊断
12、检测；血清和血液等样品的诊断检测；溶解、固定或用其他方法处理灭活的病毒和溶解、固定或用其他方法处理灭活的病毒和(或或)无传染性的病无传染性的病毒基因片段；毒基因片段；常规的细菌和毒素检查；常规的细菌和毒素检查；可能产生气溶胶的样品处理；可能产生气溶胶的样品处理；临床样品的包装、分装；临床样品的包装、分装；离心管和离心机转头的封闭和开启。离心管和离心机转头的封闭和开启。13二、实验室生物安全二、实验室生物安全 实施上述操作的人员应具备如下防护措施：实施上述操作的人员应具备如下防护措施：佩带佩带N95N95级口罩，调整口罩的鼻金属夹，保证呼吸气体确经口罩过滤；级口罩，调整口罩的鼻金属夹，保证呼吸气
13、体确经口罩过滤；佩带可以遮盖脸部的防护面罩或防护眼罩；佩带可以遮盖脸部的防护面罩或防护眼罩；佩带外科手术帽，并遮盖住双侧耳部；佩带外科手术帽，并遮盖住双侧耳部；佩带佩带2 2层外科手术乳胶手套。每完成一次可能接触含有病原的样品的操层外科手术乳胶手套。每完成一次可能接触含有病原的样品的操作后，应更换外层手套，再进行下一步操作；作后，应更换外层手套，再进行下一步操作；在普通实验白大衣外再穿着外科手术衣或连体隔离服在普通实验白大衣外再穿着外科手术衣或连体隔离服(最好为防水材料最好为防水材料)，双上肢佩带袖套，并用乳胶手套袖端将袖口覆盖、绷紧。双上肢佩带袖套，并用乳胶手套袖端将袖口覆盖、绷紧。双下肢穿
14、着裤套，双脚穿鞋套，并用鞋套上部橡皮筋将裤套下段绷紧。双下肢穿着裤套，双脚穿鞋套，并用鞋套上部橡皮筋将裤套下段绷紧。14二、实验室生物安全二、实验室生物安全 操作场地的消毒及污染物的处理：操作场地的消毒及污染物的处理：实验完毕后，应将所有可用高压消毒的用实验完毕后，应将所有可用高压消毒的用品和样品在实验室内进行高压消毒，不可用高品和样品在实验室内进行高压消毒，不可用高压消毒的物品应用压消毒的物品应用7070乙醇消毒，实验室台面乙醇消毒，实验室台面和污染的设备表面应用对脂包膜病毒有效的消和污染的设备表面应用对脂包膜病毒有效的消毒剂消毒。实验室应用紫外线灯消毒。毒剂消毒。实验室应用紫外线灯消毒。1
15、5二、实验室生物安全二、实验室生物安全 按照按照传染性非典型肺炎实验室生物传染性非典型肺炎实验室生物安全操作规范安全操作规范的要求的要求:从事从事SARSSARS患者样品临床常规检验的实验室亦患者样品临床常规检验的实验室亦应具备生物安全应具备生物安全2 2级级(BSL2)(BSL2)或以上实验室条件，或以上实验室条件，具有专用的检验室，使用专用仪器设备，如血球具有专用的检验室，使用专用仪器设备，如血球计数仪、血气分析仪、血液生化分析仪等。计数仪、血气分析仪、血液生化分析仪等。16三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存1 1、采集对象、采集对象疑似病例，临床诊断，确诊病
16、例。疑似病例，临床诊断，确诊病例。密切接触者，一周内出现流感样症状者。密切接触者，一周内出现流感样症状者。不明原因肺炎住院患者。不明原因肺炎住院患者。其他根据需要采集的对象：其他根据需要采集的对象：可能暴露于可能暴露于SARS/SARS/禽流感病禽流感病毒或潜在感染性材料的人员中出现的不明原因肺炎病例（如从事毒或潜在感染性材料的人员中出现的不明原因肺炎病例（如从事SARS/SARS/禽流感科研、检测、试剂和疫苗生产等相关工作人员）。禽流感科研、检测、试剂和疫苗生产等相关工作人员）。17三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存2 2、标本采集人员、标本采集人员 按照全国不
17、明原因肺炎病例监测实施方案按照全国不明原因肺炎病例监测实施方案（试行）的规定：（试行）的规定：经过培训的医疗机构医生、护士或疾控机构的专经过培训的医疗机构医生、护士或疾控机构的专业人员负责标本的采集，并填写标本登记表。业人员负责标本的采集，并填写标本登记表。采集标本时应按照有关规范做好个人安全防护。采集标本时应按照有关规范做好个人安全防护。18三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存3 3、标本的种类及采集时机（之一）标本的种类及采集时机（之一）上呼吸道标本：鼻拭子上呼吸道标本：鼻拭子(或咽拭子或咽拭子)、含漱液；、含漱液；下呼吸道标本：鼻咽或气管抽取液、支气管下呼吸道
18、标本：鼻咽或气管抽取液、支气管/肺肺泡灌洗液和肺组织活检标本；泡灌洗液和肺组织活检标本；血液标本：血清和血液标本：血清和EDTAEDTA抗凝全血；抗凝全血；粪便粪便/尿液标本；尿液标本；尸检标本：主要是肺和气管，应多部位取材。尸检标本：主要是肺和气管，应多部位取材。19三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存3 3、标本的种类及采集时机（之二）、标本的种类及采集时机（之二）SARSSARS预警病例的采样：预警病例的采样：至少采集鼻咽拭子（含漱液）、粪便（肛拭）和血清；至少采集鼻咽拭子（含漱液）、粪便（肛拭）和血清；急性期应尽早采集（发病后急性期应尽早采集（发病后7 7天
19、内）；恢复期在发病后天内）；恢复期在发病后2 24 4周时（发病周时（发病2020天后）采集；天后）采集；每隔每隔3 3天采集一次标本进行病毒核酸和血清抗体检测；病天采集一次标本进行病毒核酸和血清抗体检测；病程两周后程两周后,可每隔可每隔5 5天采样一次。天采样一次。20三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存3 3、标本的种类及采集时机（之三）、标本的种类及采集时机（之三）人禽流感预警病例的采样：人禽流感预警病例的采样：采集患者发病后采集患者发病后1 13 3天的咽、鼻拭子或含漱液，天的咽、鼻拭子或含漱液，发病后发病后7 7天内的急性期血清以及死亡病例的尸检天内的急性
20、期血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物，进行病毒分离、病毒核酸肺组织、气管分泌物，进行病毒分离、病毒核酸和血清抗体的检测。和血清抗体的检测。采集患者发病后采集患者发病后2 24 4周的血清标本。周的血清标本。21三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存4 4、标本采集的方法（之一）、标本采集的方法（之一）参见广东省传染性非典型肺炎实验室检测参见广东省传染性非典型肺炎实验室检测工作指引（试行）、人禽流感样品采集、运工作指引（试行）、人禽流感样品采集、运输和检测技术规范（试行）或国标流行性感输和检测技术规范（试行）或国标流行性感冒诊断标准及处理原则冒诊断标准及处理原则。
21、病毒分离标本：注意无菌操作。病毒分离标本：注意无菌操作。血清标本：双份血清；空腹采血血清标本：双份血清；空腹采血5 51010mlml。22三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存4 4、标本采集的方法（之二）、标本采集的方法（之二）鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入棉签浸入4 45ml5ml采样液中，尾部弃去。采样液中，尾部弃去。咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入样
22、将棉签头浸入4 45ml5ml采样液中，尾部弃去。采样液中，尾部弃去。23三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存4 4、标本采集的方法（之三）、标本采集的方法（之三）漱口液：用漱口液：用10ml10ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“aoao”声，让洗液咽部转动。然后收集洗液。声，让洗液咽部转动。然后收集洗液。鼻洗液：头微后仰，用移液管将鼻洗液：头微后仰，用移液管将1 11.5ml1.5ml洗液注入一侧洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发鼻孔，嘱患者同时发K K音以关闭咽腔。然后让患者低头音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或
23、烧杯收集洗液。重复数次使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复数次，最多最多可用可用101015ml15ml洗液。洗液。注意：不要使用含青霉素的标本运输液，以免过敏。注意：不要使用含青霉素的标本运输液，以免过敏。24三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存4 4、标本采集的方法（之四）、标本采集的方法（之四）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收头部并缓慢退出。收集抽取的粘
24、液，并用采样液涮洗收集器集器3 3次。次。肺活检材料：在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎肺活肺活检材料：在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎肺活检组织，用检组织，用N NS S配成配成20%20%悬液，悬液，2000rpm2000rpm离心离心10min10min，取上，取上清加入清加入相应相应抗菌素。抗菌素。25三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存4 4、标本采集的方法（之五）、标本采集的方法（之五）尿液标本：同时采集双份尿液标本：同时采集双份10ml10ml尿液分别加入两个无菌螺尿液分别加入两个无菌螺口塑料瓶中，密封，口塑料瓶中，密封，44条件下立即送至有关实验室。条
25、件下立即送至有关实验室。粪便（或肛拭子）：同时采集粪便（或肛拭子）：同时采集101020g20g粪便双份（或用粪便双份（或用塑料杆人造纤维头的肛拭子两支）分别放入两个含有塑料杆人造纤维头的肛拭子两支）分别放入两个含有10mlPBS10mlPBS或生理盐水的或生理盐水的50ml50ml无菌有螺旋盖的塑料瓶内，无菌有螺旋盖的塑料瓶内，密封，密封，44条件下立即送至有关实验室。条件下立即送至有关实验室。26三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存4 4、标本采集的方法（之六）、标本采集的方法（之六）血清标本：应包括双份血清血清标本：应包括双份血清5 510ml10ml。血液标
26、本。血液标本200020002500rpm2500rpm离心离心15min15min，收集血清，无菌条件下移至带有垫，收集血清，无菌条件下移至带有垫圈的螺旋盖塑料血清管中。可在圈的螺旋盖塑料血清管中。可在44存放一周，长期保存放一周，长期保存置存置-20-20。用。用EDTAEDTA抗凝管收集全血标本。抗凝管收集全血标本。尽量空腹采集血液标本。尽量空腹采集血液标本。上述标本（除全血外）若不能在规定时间内送出，则应上述标本（除全血外）若不能在规定时间内送出，则应尽快在尽快在70 70 保存。保存。27三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存5 5、标本的包装与运送（之一）
27、、标本的包装与运送（之一）标本必须放入合适的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里。标本必须放入合适的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里。在塑料管上用油性笔写明样本种类、采样时间、编号、在塑料管上用油性笔写明样本种类、采样时间、编号、姓名，并详细填写姓名，并详细填写“送检登记表送检登记表”，用另一塑料袋密封。，用另一塑料袋密封。将装标本的密封袋放入带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器将装标本的密封袋放入带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器内，拧紧盖，在二级容器上标明有关信息。内，拧紧盖，在二级容器上标明有关信息。将二级容器摆放在专用运输箱内（或疫苗运输箱），放将二级容器摆放在专用运输箱内（或疫苗运输箱），放入冰排，然后以柔软
28、物质填充，并密封。入冰排，然后以柔软物质填充，并密封。28三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存5 5、标本的包装与运送（之二）、标本的包装与运送（之二）同一患者两份以上标本，可以放在同一个二级容器内。同一患者两份以上标本，可以放在同一个二级容器内。二级容器要承受不少于二级容器要承受不少于9595KpaKpa的压力，内衬具吸水和缓冲的压力，内衬具吸水和缓冲能力的柔软物质。能力的柔软物质。病毒分离标本可将一级容器直接放入液氮运输罐内运输。病毒分离标本可将一级容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。所有容器必须印有生物危险标识。标本不得邮寄；应使用航空
29、或铁路运输；近距离样品运标本不得邮寄；应使用航空或铁路运输；近距离样品运送最好使用专车专人（送最好使用专车专人（2 2人）。人）。29三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存6 6、标本的保存、标本的保存用于病毒分离标本应尽快接种，用于病毒分离标本应尽快接种，2424h h内接种的可内接种的可于于44暂存；不能在暂存；不能在2424h h内接种的置内接种的置-70-70保存；保存；如无如无-70-70保存条件，则于保存条件，则于-20-20冰箱暂存。冰箱暂存。血清标本可在血清标本可在44保存保存1 13 3天，天，-20-20或以下可长或以下可长期保存；标本运送期间应避
30、免反复冻融。期保存；标本运送期间应避免反复冻融。所有标本一式两份，其中一份单独保存备复核。所有标本一式两份，其中一份单独保存备复核。30三、标本的采集、包装、运送及保存三、标本的采集、包装、运送及保存7 7、标本的接收、标本的接收广州、深圳、佛山、韶关、汕头、云浮、湛江和广州、深圳、佛山、韶关、汕头、云浮、湛江和珠海市珠海市CDCCDC为本辖区内标本接收指定单位，并开为本辖区内标本接收指定单位，并开展相关的实验室检测工作。展相关的实验室检测工作。广东省广东省CDCCDC负责其它地级市样本的接收和检测工负责其它地级市样本的接收和检测工作。并对复核样本检测、鉴定和上送中国作。并对复核样本检测、鉴定
31、和上送中国CDCCDC。以上指定实验室实行以上指定实验室实行2424小时标本接收制。小时标本接收制。31四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测1 1、经典检测方法、经典检测方法病毒分离与鉴定：不适用常规检测，用于科研和疑难病例鉴定。病毒分离与鉴定：不适用常规检测，用于科研和疑难病例鉴定。SARS-SARS-CoVCoV：接种人胚肺细胞或猴肾细胞培养分离病毒，再用补体结接种人胚肺细胞或猴肾细胞培养分离病毒，再用补体结合试验或中和试验、合试验或中和试验、IFAIFA或或ELISAELISA等鉴定抗原。等鉴定抗原。禽流感：用禽流感：用SPFSPF鸡胚单腔法和鸡胚单腔法和MDCKMD
32、CK组织细胞分离培养，培养物用血凝组织细胞分离培养，培养物用血凝试验（试验（HAHA）和和H5H5血凝抑制试验（血凝抑制试验（HIHI）鉴定。鉴定。微量血清中和实验微量血清中和实验:H5H5活病毒，必须在活病毒，必须在BSL-3BSL-3级实验室里操作。级实验室里操作。（具体操作参见国标流行性感冒诊断标准及处理原则）（具体操作参见国标流行性感冒诊断标准及处理原则）32四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测2 2、快速检测方法、快速检测方法1 1）分子生物学检测：）分子生物学检测：RT-PCRRT-PCR或或Real-Time PCRReal-Time PCRSARS-SARS
33、-CoVCoV核酸检测核酸检测禽禽H5H5亚型流感病毒核酸检测亚型流感病毒核酸检测2 2）检测抗原的快速诊断试剂盒：）检测抗原的快速诊断试剂盒：敏感性较低，只能敏感性较低，只能检测型特异性抗原。检测型特异性抗原。3 3）免疫荧光测定）免疫荧光测定33四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测 SARS-SARS-CoVCoV核酸检测试剂核酸检测试剂 首选国家推荐使用的试剂：首选国家推荐使用的试剂：深圳匹基的深圳匹基的SARS-SARS-CoVCoV Real-time PCRReal-time PCR检测试剂。检测试剂。中大达安基因的中大达安基因的SARS-SARS-CoVCoV
34、 Real-time PCRReal-time PCR检测试剂。检测试剂。如果有条件，可以使用以下核酸检测试剂：如果有条件，可以使用以下核酸检测试剂：美国美国CDCCDC研制研制SARS-SARS-CoVCoV Real-time PCRReal-time PCR核酸检测试剂。核酸检测试剂。德国罗氏德国罗氏RT-PCRRT-PCR核酸检测试剂，结果必须要测序。核酸检测试剂，结果必须要测序。德国德国ArtusArtus的的SARS-SARS-CoVCoV Real-time PCRReal-time PCR核酸检测试剂。核酸检测试剂。34四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测
35、SARS SARS检测结果的确认检测结果的确认 应用应用PCRPCR方法，符合下列三项之一者判断为阳性：方法，符合下列三项之一者判断为阳性：同一份临床标本在两个检测实验室使用两种不同的方法，同一份临床标本在两个检测实验室使用两种不同的方法，或重复或重复PCRPCR方法检测阳性；方法检测阳性；至少两个不同部位的标本（如咽拭和粪便）检测阳性；至少两个不同部位的标本（如咽拭和粪便）检测阳性；不同病程（至少间隔不同病程（至少间隔2 2天）采集的同一种标本（如两份天）采集的同一种标本（如两份或多份咽拭）检测阳性；或多份咽拭）检测阳性；平行检测进展期和恢复期的血清抗体，发生阳转或平行检测进展期和恢复期的血
36、清抗体，发生阳转或4 4倍倍以上升高，可做出以上升高，可做出SARS-SARS-CoVCoV感染的实验室检测报告。感染的实验室检测报告。35四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测 禽禽H5H5亚型流感病毒核酸检测试剂亚型流感病毒核酸检测试剂用于禽用于禽H5H5亚型流感病毒快速检测、测序及排除；亚型流感病毒快速检测、测序及排除；建议使用中国流感中心或建议使用中国流感中心或WHOWHO等权威部门推荐的引物和等权威部门推荐的引物和探针；探针；建议使用德国建议使用德国QIAGENQIAGEN的的RneasyRneasy Mini Kit(Mini Kit(病毒核酸提病毒核酸提取取)和
37、和QIAquickQIAquick Gel Extraction Kit(PCR Gel Extraction Kit(PCR产物纯化产物纯化)产产品。（源于禽流感实验室检测技术方案）品。（源于禽流感实验室检测技术方案）36四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测 以下情况的禽流感疑似病例原始标本及分以下情况的禽流感疑似病例原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认：离物送国家流感中心检测、复核、确认：分离物分离物HAHA（+），同时），同时HIHI（-），H5H5的的RT-PCRRT-PCR检测阳性；检测阳性；分离物分离物HAHA（+），），同时同时HIHI（+）或或H5
38、H5的的RT-PCRRT-PCR检测阳性；检测阳性；分离物分离物HAHA（+），），同时同时H5H5的的RT-PCRRT-PCR检测阳性检测阳性;病人恢复期血清比急性期病人恢复期血清比急性期H5H5抗体有抗体有4 4倍或以上增高倍或以上增高;标本分离阳性，标本分离阳性，HIHI（-），并已排除当前流行甲、乙型，并已排除当前流行甲、乙型毒株的可能。毒株的可能。（HA-HA-血凝实验血凝实验;HI-H5;HI-H5血凝抑制试验）血凝抑制试验）37四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测3 3、血清学试验、血清学试验SARS-SARS-CoVCoV抗体：抗体：包括包括IgGIgG、I
39、gMIgM或总抗体，任何一种抗或总抗体，任何一种抗体发生阳转或体发生阳转或4 4倍及以上升高，均可诊断倍及以上升高，均可诊断SARSSARS。因因IgGIgG抗抗体持续时间较长，最好检测体持续时间较长，最好检测IgGIgG抗体。抗体。禽流感病毒抗体：禽流感病毒抗体：采集急性期和恢复期的双份血清同采集急性期和恢复期的双份血清同步检测。恢复期抗体滴度增高步检测。恢复期抗体滴度增高4 4倍或以上判断为阳性。倍或以上判断为阳性。其他抗体：其他抗体：有条件的单位首先要做支原体、衣原体、有条件的单位首先要做支原体、衣原体、HIVHIV、RSVRSV、腺病毒、流感病毒、军团菌等的排查检测。腺病毒、流感病毒、
40、军团菌等的排查检测。38四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测 SARS-SARS-CoVCoV抗体检测试剂抗体检测试剂 首选国家推荐使用的试剂：首选国家推荐使用的试剂：北京华大吉比爱公司的北京华大吉比爱公司的SARS-SARS-CoVCoV IgMIgM/IgGIgG抗体抗体ELISAELISA检测试剂盒。检测试剂盒。军事医学科学院的军事医学科学院的SARS-SARS-CoVCoV IgMIgM/IgGIgG抗体抗体IFAIFA检测试剂盒。检测试剂盒。如果有条件，可以使用以下抗体检测试剂：如果有条件，可以使用以下抗体检测试剂：欧盟（欧盟（EuroImmunonEuroImm
41、unon）研制的研制的SARS-SARS-CoVCoV IgMIgM/IgGIgG抗体抗体IFAIFA检测试剂盒。检测试剂盒。香港大学研制的香港大学研制的SARS-SARS-CoVCoV IgMIgM/IgGIgG抗体抗体IFAIFA检测试剂盒。检测试剂盒。（源于广东省传染性非典型肺炎实验室检测工作指引（试行）（源于广东省传染性非典型肺炎实验室检测工作指引（试行）39四、不明原因肺炎的实验室检测四、不明原因肺炎的实验室检测 4 4、常规实验室检测项目、常规实验室检测项目外周血象：外周血象：外周血白细胞计数外周血白细胞计数（WBCWBC）正常或降低，淋巴细胞计正常或降低，淋巴细胞计数绝对值减少，
42、并呈逐步减低趋势。数绝对值减少，并呈逐步减低趋势。T T淋巴细胞亚群：淋巴细胞亚群：大多数大多数SARSSARS患者外周血患者外周血CDCD3 3、CDCD4 4、CDCD8 8T T淋淋巴细胞亚群减低，尤以巴细胞亚群减低，尤以CDCD4 4减低明显；减低明显；CDCD4 4/CDCD8 8比值正常或减低。比值正常或减低。大部分禽流感患者大部分禽流感患者CDCD4 4/CDCD8 8比值倒置。比值倒置。低氧血症：低氧血症：SARSSARS患者动脉血血氧饱和度和氧分压都有不同程度患者动脉血血氧饱和度和氧分压都有不同程度下降，下降程度与病情严重程度密切相关。下降，下降程度与病情严重程度密切相关。（
43、WHO也报告，SARS的典型临床改变就是发热、肺部实变、血氧饱和度和氧分压下降。）其他：其他：多数患者表现有肝功能和多数患者表现有肝功能和LDLD、CKCK的异常，并伴有电解质代的异常，并伴有电解质代谢紊乱。符合病毒性疾病引起多器官损害的特点。谢紊乱。符合病毒性疾病引起多器官损害的特点。40五、实验室检测应注意的问题五、实验室检测应注意的问题标本采集的时机：标本采集的时机：采集不到急性期（发病采集不到急性期（发病7 7天内）血清时，天内）血清时，尽可能采集早期血清以了解抗体动态变化。尽可能采集早期血清以了解抗体动态变化。标本的上送及转运标本的上送及转运实验室生物安全：实验室生物安全：加强检测标本和加强检测标本和SARS/SARS/禽流感病毒毒株禽流感病毒毒株的管理，严格执行操作规范，防止实验室的感染及传播。的管理，严格执行操作规范，防止实验室的感染及传播。标本保存的条件：标本保存的条件：流感病毒在流感病毒在-20-20-40-40时不稳定，长时不稳定，长期保存应在期保存应在-70-70温度以下。温度以下。41谢谢！
