1、2023-1-171 转基因小鼠技术转基因小鼠技术 -转基因小鼠的构建转基因小鼠的构建李懿萍李懿萍2010.05.202023-1-172基因打靶的简易程序基因打靶的简易程序2023-1-173优点：优点：外源基因整合情况的可控性高外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性表达的水平及插入的稳定性外源基因导入外源基因导入ESES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便选方便缺点：缺点：ESES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难维持维持ESES细胞的未分化及多向分化潜能不易
2、细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体所得个体为嵌合体胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESES细胞）法细胞）法2023-1-1742023-1-175主要是利用反转录病毒的长末端重复序列主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)(LTR)区区域具有转录启动子活性的特点域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到将外源基因连接到LTRLTR下游进行基因重组后下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗再包装成为高滴度病毒颗粒粒,去去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中中,携带外携带外源基因的反转录病毒源基因的反转录病毒DNADNA可以可以整合到宿主染色体整合到宿主染色
3、体上。上。3 3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法2023-1-1763 3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法优点优点由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNADNA中的中的高度整合特性高度整合特性,大大提高基因转移的效率大大提高基因转移的效率细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体缺点缺点获得纯合体的转基因动物的机会少获得纯合体的转基因动物的机会少病毒载体构建复杂病毒载体构建复杂转入的外源基因的大小受到限制
4、转入的外源基因的大小受到限制,10kb,300kb300kb。F F因子（因子（F F质粒）是一种质粒）是一种“性质粒性质粒”，可转移至，可转移至F F-宿主细胞。宿主细胞。100kb,100kb,近百个蛋白质。近百个蛋白质。可构建可构建BACBAC文库；文库；有单一的有单一的loxploxp位点，利于图谱分析（借助标记位点，利于图谱分析（借助标记loxploxp和和crecre 重组酶；重组酶；BACBAC载体两端有载体两端有Sp6Sp6和和T7 T7 引物序列利于测序，确定基因的引物序列利于测序，确定基因的 染色体定位；染色体定位；可稳定遗传，易于操作。可稳定遗传，易于操作。BAC文库：基
5、因组酶切后100300kbDNA+BAC大肠杆菌2023-1-1714方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒基因敲除精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术外源DNA的整合率高；整合在生殖细胞中的比例也很高。可在整合点整合转移基因的单个拷贝；该方法简单、方便 缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 应用具有一定局限性有些结果不能重复
6、基因转移方法的比较基因转移方法的比较2023-1-1715Electroporation2023-1-17162023-1-17172023-1-17182023-1-17192023-1-17201234562023-1-17211256432023-1-17222023-1-17232023-1-17242023-1-1725 转基因小鼠技术转基因小鼠技术-转基因小鼠在科研中的应用转基因小鼠在科研中的应用2023-1-17261.1.7500万万1.25亿年前亿年前-人鼠始祖人鼠始祖小鼠的历史小鼠的历史2.2.19世纪世纪-宠物鼠宠物鼠-实验鼠的实验鼠的“先驱先驱”3.3.1897年年-重
7、组表型重组表型 2023-1-17274.1900年年-从宠物鼠到实验鼠从宠物鼠到实验鼠Abbie Lathrop-饲养宠物鼠饲养宠物鼠1902年，年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传购买老鼠，用于遗传学研究。哈佛大学学研究。哈佛大学-老鼠的毛色进行观察，以检测老鼠的毛色进行观察，以检测孟德尔法则的正确性。孟德尔法则的正确性。小鼠的历史小鼠的历史5.1905年年-孟德尔老鼠孟德尔老鼠 通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家Lucien Claude Cuno 发现，两个携带黄色皮毛基因发现，两个携带黄色皮毛基因的老鼠
8、之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老鼠的数量比总是鼠的数量比总是2:1。-这是报道的第一个等位纯合这是报道的第一个等位纯合致死的基因。致死的基因。2023-1-1728Clarence Cook Little是一个来自于是一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家，他培育实验室的哈佛大学生物学家，他培育出了第一个近亲繁殖的小鼠株系出了第一个近亲繁殖的小鼠株系DBA。小鼠的历史小鼠的历史6.1909年年-实验鼠的诞生实验鼠的诞生Clarence Little 和和 Ernest Tyzzer 发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不发
9、现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。7.1916年年-肿瘤易受性和组织相容性肿瘤易受性和组织相容性 Jackson实验室的实验室的George Snell在在1940年代发现了组织相容性基因年代发现了组织相容性基因-荣荣获了获了1980年的年的诺贝尔奖诺贝尔奖 2023-1-17298.1921年年-C57BL株系株系 基因组基因组测序在测序在2002年完成年完成 小鼠的历史小鼠的历史9.1929年年-Jackson 实验室实验室-世界上最重要的小鼠遗传学研究中心世界上最重要的小鼠遗传学研究中心
10、 在在Hudson 汽车公司的头目汽车公司的头目Edsel Ford和和Roscoe Jackson两位大财主的资助下，两位大财主的资助下，Charence Little 在美国缅因州在美国缅因州Bar Harbor 建立了建立了Jackson 实验室实验室 2023-1-173010.1953年年-DNA双螺旋双螺旋Crick，Watson和和Wilkins三人因为这项三人因为这项杰出的成就荣获了杰出的成就荣获了1962年的年的诺贝尔奖诺贝尔奖。11.1966年年-遗传密码破译遗传密码破译 Robert Holly，Har Gobind Khorana 和和 Marshall Nirenbe
11、rg 破破译了遗传密码译了遗传密码-1968年的年的诺贝尔奖诺贝尔奖 小鼠的历史小鼠的历史2023-1-173112.1972年年-小鼠遗传学的计算机数据库小鼠遗传学的计算机数据库 Jackson 实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库 13.1977年年-Sanger 测序法测序法 和同事和同事Walter Gilbert分享了分享了1980年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖-人类和小鼠人类和小鼠基因基因组组测序过程中的主要技术测序过程中的主要技术 14.1982年年-转基因转基因小鼠小鼠 小鼠的历史小鼠的历史2023-1-173216.198
12、7-89年年-第一只基因敲除小鼠第一只基因敲除小鼠 Martin Evans，Oliver Smithies 和和 Mario Capecch 领导的几领导的几个研究小组个研究小组-2001获得了获得了Lasker奖奖 17.1996年年-“百慕大法则百慕大法则”公共公共基因组基因组序列数据序列数据 18.1998年年-克隆鼠克隆鼠 1997年克隆羊年克隆羊“多莉多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠第一批克隆鼠“Cumulina”和她的姐妹们。和她的姐妹们。15.1983年年-PCR Kary Mullis-1993年的年的诺贝尔奖诺贝尔奖 小
13、鼠的历史小鼠的历史2023-1-173319.1999年年-小鼠小鼠基因组基因组测序协会测序协会人类人类基因组基因组三个主要测序中心（三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute,The Whitehead Center for Genome Research 和和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠）成立了一个相互协作的小鼠基因基因组组测序机构，取名为小鼠测序机构，取名为小鼠基因组基因组测序协会（测序协会（Mouse Genome Sequencing Consor
14、tium,MGSC)20.2001年年2月月-人类人类基因组基因组 21.2001年年6月月-散弹法散弹法美国公司美国公司Celera Genomics 使用散弹法测得了使用散弹法测得了用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一次性测得次性测得基因组基因组全序列的技术。全序列的技术。小鼠的历史小鼠的历史2023-1-173422.2002年年5月月-16号染色体与已被分析的人类号染色体与已被分析的人类 21号染色体序列高度相似号染色体序列高度相似23.2002年年8月月-小鼠小鼠基因组基因组物理图谱物理图谱 24.2002年年12月月-小鼠小鼠基因组基因组小鼠
15、小鼠基因组基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组基因组序列草图，序列草图，并且同时对并且同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个小鼠株系做了分析。这个基因组基因组大小约为大小约为2.5Gb，比人类，比人类基因组基因组要小，预计的基因也少于要小，预计的基因也少于30000个。约有个。约有40%的小鼠和人类的小鼠和人类基因组基因组序列相高度似性，序列相高度似性，80%的人类基因在小的人类基因在小鼠鼠基因组基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组成的其它方面做了详细讨论。在日本成的其它方面做了详细讨论
16、。在日本RIKEN 基因组基因组科学实验室科学实验室的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。小鼠的历史小鼠的历史2023-1-1735转基因小鼠技术的应用转基因小鼠技术的应用基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究基因工程定向育种基因工程定向育种转基因动物生物反应器研制转基因动物生物反应器研制 人类疾病小鼠模型与基因治疗人类疾病小鼠模型与基因治疗药理学研究药理学研究器官移植器官移植环境科学研究环境科学研究2023-1-1736基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究基因表达调控、基因功能及发育调控
17、作用的研究Hox gene(Hox gene(同源异形盒基因）同源异形盒基因）疾病基因疾病基因学习与记忆基因学习与记忆基因生理周期基因生理周期基因基因表达有时空与组织的特异性；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；2023-1-1737基因工程定向育种基因工程定向育种向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达，向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达，能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种之间遗传物质的交换。之间遗传物质的交换。实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其精华，快速创造新的目的变异和固定
18、扩展变异，精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异，从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。转基因羊、猪、鸡、鱼、鼠等2023-1-1738转基因动物生物反应器研制转基因动物生物反应器研制转基因动物生物反应器概念：转基因动物生物反应器概念：将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基组织的分泌液、浸出液或血清中分
19、离提取目的基因产物。因产物。乳腺乳腺-理想器官理想器官 肾脏和膀胱肾脏和膀胱多肽药物、蛋白质疫苗、酶类多肽药物、蛋白质疫苗、酶类细菌-动物细胞-转基因动物2023-1-1739乳腺生物反应器具有以下特点：乳腺生物反应器具有以下特点：乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器；乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器；一头奶牛一年可生产乳蛋白250300Kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白2530Kg。如果有百分之
20、一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品；接近天然产品；在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。生产群体。转基因动物生物反应器研制转基因动物生物反应器研制2023-1-1740转基因动物生物反应器研制转基因动物生物反应器研制乳腺组织特异表的基因：乳腺组织特异表的基因：具具milk boxmilk box保守序列
21、保守序列 -乳清蛋白基因乳清蛋白基因-b b乳球蛋白基因乳球蛋白基因-酪蛋白基因酪蛋白基因已开发的产物：已开发的产物：-血栓治疗药物血栓治疗药物（组织型纤溶酶原激活因子)-出血性疾病（出血性疾病（凝血因子VIII，IX）-免疫治疗药物免疫治疗药物（IFN，IL，TNF）-营养制剂营养制剂(人乳铁蛋白）2023-1-1741人类疾病小鼠模型与基因治疗人类疾病小鼠模型与基因治疗癌症癌症-肺癌肺癌-p53-p53功能缺陷功能缺陷遗传病遗传病-地中海贫血地中海贫血（临床失败-细胞表达？）AD -对AD患者死亡后脑部解剖发现脑部存积了一种淀粉状蛋白 -将人类淀粉状蛋白的基因转到大鼠体内使其发病，再清除淀
22、粉状蛋白，发现能够减慢甚至停止病情2023-1-1742药理学研究药理学研究胰岛胰岛b b细胞细胞B7-1B7-1转基因小鼠对转基因小鼠对STZSTZ敏感敏感阿霉素抗癌，但心脏毒性等副作用大阿霉素抗癌，但心脏毒性等副作用大-金属硫蛋白MT具保护作用P P糖蛋白糖蛋白-肿瘤多药耐药肿瘤多药耐药-knockout mice证实其影响药物的分布与清除2023-1-1743器官移植器官移植超急性排斥反应超急性排斥反应补体激活的阻断补体激活的阻断-免疫抑制剂危险免疫抑制剂危险补体活性调节因子的负调控补体活性调节因子的负调控-膜辅助因子膜辅助因子MCPMCP-衰退促进因子衰退促进因子hDAP/hCD59h
23、DAP/hCD591999-1999-猪心猪心猕猴（器官大小）猕猴（器官大小）2023-1-1744环境科学研究环境科学研究生物可利用性的分析只能在活体研究生物可利用性的分析只能在活体研究毒理毒理/环境基因组学环境基因组学转基因线虫转基因线虫-HSP16/lacZ-HSP16/lacZ2023-1-1745转基因小鼠技术的主要问题转基因小鼠技术的主要问题外源基因的整合率低外源基因的整合率低外源基因的表达不理想外源基因的表达不理想成本高成本高转基因给动物造成转基因给动物造成插入突变和机能紊乱插入突变和机能紊乱转基因动物成活率低转基因动物成活率低转基因动物产品的安全性转基因动物产品的安全性改善外源
24、基因转移方法改善外源基因转移方法定点整合定点整合-cre/loxp-cre/loxp组织特异性启动子组织特异性启动子生态生态/遗传遗传/食品安全食品安全结合动物克隆技术结合动物克隆技术-Dolly&Polly-Dolly&Polly2023-1-17462023-1-1747参考文献参考文献现代细胞分子生物学技术现代细胞分子生物学技术-科学出版社，林菊生主编科学出版社，林菊生主编精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南-科学出版社，颜子颖科学出版社，颜子颖/王海林译王海林译小鼠胚胎操作实验手册小鼠胚胎操作实验手册-化学工业出版社，孙青原化学工业出版社，孙青原/陈大元译陈大元译基因工程小鼠基
25、因工程小鼠-上海科学技术出版社，傅继梁主编上海科学技术出版社，傅继梁主编Transgenic mouse-methods and protocols-MH Hofker&Jan van Deursen2023-1-1748参考文献参考文献http:/www.informatics.jax.org（Jackson lab，小鼠基因组资料库）http:/www.afcs.org(细胞信号同盟）细胞信号同盟）Palmiter RD,et al.,Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothion
26、ein-growth hormone fusion genes.Nature,1982,300(5893):611Gu H,et al.,Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-Loxp-mediated gene targeting.Cell,1993,73(6):11552023-1-1749作作 业业近五年英文文章一篇近五年英文文章一篇 集中于转基因小鼠的制作、解析及相关疾病的研究集中于转基因小鼠的制作、解析及相关疾病的研究学习笔记（学习笔记（1000-2000字）字）解决问题解决问题选用方法选用方法结果分析结果分析研究意义研究意义总体评价（从立题、实验设计、结果分析及实际意义）总体评价（从立题、实验设计、结果分析及实际意义）E-Mail:2023-1-1750
