1、目的要求：目的要求：通过本章的学习，使学生掌握细菌基因重组，真菌基因重通过本章的学习，使学生掌握细菌基因重组，真菌基因重组和微生物诱变育种的基本原理和方法。组和微生物诱变育种的基本原理和方法。要求掌握：要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理、基因工程的基本原理5、基因表达的调控、基因表达的调控重重 点：点：基因突变及修复、细菌的基因重组基因突变及修复、细菌的基因重组难难 点：点：低频转导，高频转导，低频转导，高频转导，准性生
2、殖，基因表达的调控准性生殖，基因表达的调控 遗传遗传：亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（遗传（inheritance）和变异（和变异（variation）是生命的最本质特性之一是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：(genotype)表型表型：(phenotype)生物的全部遗传因子所携带的遗传信息生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。的总和。表型是由遗
3、传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。遗传型遗传型环境条件环境条件表型表型表型饰变：表型饰变：表型的差异只与环境有关，不涉及遗传物质结构改变，只发生在转录、转译水表型的差异只与环境有关，不涉及遗传物质结构改变，只发生在转录、转译水平上的表型变化平上的表型变化特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因突变）遗传型变异（基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为（自发突变频率通常为1010-6
4、-6-10-10-9-9）Production of a red pigment(prodigiosin)by Serratia marcescens（粘质沙雷氏菌）粘质沙雷氏菌）.From left to right:slant culture grown at 25C,slant culture grown at 37C,broth culture grown at 25C,broth culture grown at 37C.微生物是遗传学研究中的明星：微生物是遗传学研究中的明星：t 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。方便建立纯
5、系。t 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖。量生长繁殖。t 物种和代谢类型多样物种和代谢类型多样t 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。操作性强。第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础1、经典转化实验、经典转化实验肺炎链球菌：肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力）致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）致病能力）一、三个证明核酸是遗传物质的经典实验一、三个证明核酸是遗传物质的经典实
6、验1928年，年，F.Griffth的转化实验的转化实验1944年，年，Avery的转化实验，确定了转化因子的转化实验，确定了转化因子实验证明，将实验证明，将R菌转化为菌转化为S菌的转化因子是菌的转化因子是DNA！2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验实验证明，进入细菌细胞内部的物质是实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有包含有产生完整噬菌体的全部信息。产生完整噬菌体的全部信息。32P标记标记DNA35S标记蛋白质标记蛋白质3、植物病毒、植物病毒TMV重建实验重建实验实验证明，实验证明，TMV的遗传物质是的遗传物质是RNA。朊病毒的发现和思考朊病毒的发现和思考:朊病毒朊病毒蛋白质是
7、遗传物质蛋白质是遗传物质？1、细胞水平、细胞水平2、细胞核水平、细胞核水平3、染色体水平、染色体水平4、核酸水平、核酸水平5、基因水平、基因水平6、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式（一）遗传物质在（一）遗传物质在7个水平上的形式个水平上的形式1、细胞水平、细胞水平真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核原核微生物：核区原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平、细胞核水平真核生物真核生物 细胞核细胞核 核染色体核染色体原核生物原
8、核生物 核区核区 DNA链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质3、染色体水平、染色体水平真核生物染色体是由组蛋真核生物染色体是由组蛋白与白与DNA构成的线状结构构成的线状结构真核生物通常为多倍体真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有闭原核生物的染色体只有闭合环状的合环状的DNA链链原核生物为单倍体原核生物为单倍体染色体的数目在不同的生染色体的数目在不同的生物中是不同的物中是不同的4、核酸水平、核酸水平核酸种类：核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状环状，线状，超螺旋状DNA
9、长度：因种而异长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。研究微生物学的最有力的手段。5、基因水平、基因水平它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。片段。1909年年 丹麦生物学家丹麦生物学家WJohansen结构基因：结构基因：是为细胞结构、组成是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶如细胞生化反应所需的酶)及及 完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因完
10、成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：调节基因：用于编码调节蛋白的基因用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：操纵基因：是位于启动子和结构基因之间的一段碱基顺序，是位于启动子和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转 录是否能进行。录是否能进行。重复基因：重复基因：DNA片段重复片段重复跳跃基因：跳跃基因：可在可在DNA上转上转移位置的基因（移位置的基因（ISIS因子、因子、TnTn因子）因子）6、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位核苷酸是最小突变单位和交换单位（二）微生物
11、基因组结构的特点（二）微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌）的基因组、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短
12、；）基因组的重复序列少而短；2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在分布在16条染色体中。条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；4）重复序列多；）重复序列多；第一个完成基因组测序的真核生物基因组第一个完成基因组测序的真核生物基因组2、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌第一个完成基因组测序的古生菌1)
13、只有只有40的基因与其他两界的生物有同源性的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌古生菌的基因组在结构上类似于细菌 1.66x106bp的环状染色体的环状染色体DNA 1682个个ORF(Open Reading Frame)3)负责信息传递功能的基因（复制负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似、转录和翻译）则类似于真核生物于真核生物（三）转座因子（三）转座因子转座因子：转座因子：细胞中能细胞中能改变自身位置改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段
14、DNA序列序列。插入序列（插入序列（insertion sequence,IS)转座子（转座子（transposon,Tn)某些病毒（某些病毒（Mu噬菌体）噬菌体）原核生物的转座因子：原核生物的转座因子：转座的遗传学效应：转座的遗传学效应：1）插入突变）插入突变2）产生染色体畸变）产生染色体畸变3）基因的移动和重排）基因的移动和重排质粒通常不含有细胞初级质粒通常不含有细胞初级代谢的遗传信息，代谢的遗传信息，而含有而含有关于次级代谢的遗传信息关于次级代谢的遗传信息质粒是独立存在于细菌染色体外或附加在染色体上质粒是独立存在于细菌染色体外或附加在染色体上的遗传物质。它由一共价闭合环的遗传物质。它由一
15、共价闭合环DNA分子组成。分子组成。（四）染色体外的遗传因子（四）染色体外的遗传因子质粒（质粒（Plasmid）1、致育因子致育因子(fertility factor,F因子因子)l又称又称F质粒质粒，一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用），一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。有关的质粒。l携带携带F F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F+菌株菌株（相当于雄性），（相当于雄性），无无F F质粒质粒的菌株称为的菌株称为F F-菌株菌株(相当于雌性相当于雌性)。lF F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称为质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称为高频重组菌株高频重组菌株（high freq
16、uence recombination,简称简称Hfr)l由于由于F因子能以因子能以游离状态游离状态(F+)和以和以与染色体相结合与染色体相结合的状态的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为存在于细胞中，所以又称之为附加体附加体(episome)。质粒的类型质粒的类型:2、抗性因子、抗性因子(resistancefactor，R因子因子)l另一类另一类普遍而重要普遍而重要的质粒，主要包括的质粒，主要包括抗药性和抗重金属抗药性和抗重金属二大类，二大类，简称简称R质粒质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其它。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其它药物呈现抗性。药物呈现抗性。l例如
17、例如R1质粒质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素氯霉素(Cm)、链霉素链霉素(Sm)、磺胺磺胺(Su)、氨苄青霉素氨苄青霉素(Ap)、卡那霉素卡那霉素(Km)。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。抗性质粒上。l许多许多R质粒能使质粒能使宿主细胞宿主细胞对许多对许多金属离子呈现抗性金属离子呈现抗性，包括碲，包括碲(Te6+)、砷砷(As3+)、汞汞(Hg2+)、镍镍(Ni2+)、钴钴(Co2+)、银银(Ag+)、镉镉(Cd2+)等。在肠道细菌中发现的等。在肠道细菌中发现的R质粒，约有质粒，约有2
18、5是抗汞离子的，是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占而铜绿假单胞菌中约占75。3 3、细菌素质粒、细菌素质粒 ColCol质粒含有编码大肠菌素的基因质粒含有编码大肠菌素的基因 4 4、毒性质粒、毒性质粒 具有编码毒素的基因具有编码毒素的基因5 5、降解降解质粒质粒 携带有能降解某些物质的酶的基因携带有能降解某些物质的酶的基因 6 6、共生质粒、共生质粒 携带有与固氮有关的基因携带有与固氮有关的基因7 7、代谢型质粒、代谢型质粒 控制某一特殊代谢过程控制某一特殊代谢过程8 8、隐蔽质粒隐蔽质粒此类质粒不显示任何表型效应，只有通过物理的方法检测其存在此类质粒不显示任何表型效应，只有通过物理的方法检测
19、其存在 松弛型质粒松弛型质粒（relaxed plasmid)：质粒在宿主中可以有质粒在宿主中可以有10100个拷贝，也称为高拷贝数质粒。个拷贝，也称为高拷贝数质粒。严谨型质粒严谨型质粒(stringent plasmid)：质粒在每个宿主细胞中质粒在每个宿主细胞中只有只有14个拷贝，也叫低拷贝数质粒。个拷贝，也叫低拷贝数质粒。窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒：质粒的复制起点较特异，只能在一种：质粒的复制起点较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制。特定的宿主细胞中复制。广宿主范围质粒广宿主范围质粒：质粒的复制起点不太特异，可以在许：质粒的复制起点不太特异，可以在许多种细菌中复制。多种细菌中复制。1
20、 1、不亲和性、不亲和性 可以共存于同一细胞中的不同质粒彼此是亲和的，可以共存于同一细胞中的不同质粒彼此是亲和的，而不能共存于同一细胞的质粒彼此不亲和，质粒的而不能共存于同一细胞的质粒彼此不亲和，质粒的这种特性称为这种特性称为不亲和性不亲和性。2 2、可消除性、可消除性 3 3、能自我复制，稳定的遗传；、能自我复制，稳定的遗传；4 4、没有质粒的细菌不能自发的产生质粒、没有质粒的细菌不能自发的产生质粒,但可以通过但可以通过转化、转导或接合作用的转移获得质粒；转化、转导或接合作用的转移获得质粒；5 5、质粒可以携带供体细胞的、质粒可以携带供体细胞的DNADNA转移。转移。2 2、可作为基因转移的
21、载体。、可作为基因转移的载体。1 1、质粒控制细菌的某一遗传性状；、质粒控制细菌的某一遗传性状；第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 基因突变：基因突变：一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可序列的任何可 遗传的改变。遗传的改变。基因基因突变突变狭义：点突变（狭义：点突变（一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）野生型（原始性状）野生型（原始性状）基因突变基因突变突变型（新性状）突变型（新性状）广义：基因突变和染色体畸变（广义：基因突变和染色体畸变（大片段染色体的缺失、重大片段染色体的缺失、重 复、倒位复、倒位）一、基因突
22、变的定义一、基因突变的定义自发突变：自发突变：在自然条件下发生的基因突变。在自然条件下发生的基因突变。诱发突变：诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。回复突变：回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。基因基因突变突变分为分为 二、基因突变的类型二、基因突变的类型同义突变：同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化。碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化。错义突变：错义突变：碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化。碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化。无义突变：无义突变：碱基的改变使得密码子
23、变为终止密码子。碱基的改变使得密码子变为终止密码子。移码突变：移码突变：碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变，碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变，从而使氨基酸序列完全变化。从而使氨基酸序列完全变化。不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：U常见的微生物突变体类型：常见的微生物突变体类型：1、营养缺陷型（、营养缺陷型（auxotroph）特点：特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记负选择标记（突变株不能通过选择平板直接获得）（突变株不能通过选择平板直接获得）缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型。缺乏合
24、成其生存所必需的营养物的突变型。影印平板（影印平板（Replica plating）法是法是LederbergLederberg夫妇在夫妇在19521952年建立年建立2、抗药性突变型（、抗药性突变型（resistant mutant)由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的突变型。抗生素，产生抗性的突变型。3、条件致死突变型、条件致死突变型(conditional lethal mutant)在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。致死效应的突变型。4、形态突变
25、型、形态突变型(morphological mutant)指造成形态改变的突变型。指造成形态改变的突变型。5、其他突变型、其他突变型 1）自发性）自发性 2）不对应性）不对应性 3）稀有性）稀有性 4）规律性）规律性 三、基因突变的机制三、基因突变的机制 5）独立性）独立性 6）可诱变性）可诱变性 7）遗传性）遗传性 8）可逆性）可逆性1、基因突变的特点：、基因突变的特点：基因突变自发性和不对应性的实验证明：基因突变自发性和不对应性的实验证明：三个经典实验三个经典实验变量实验变量实验涂布实验涂布实验影印实验影印实验证明突变是自发产生证明突变是自发产生的，并且突变的性状的，并且突变的性状与引起突
26、变的原因间与引起突变的原因间无直接对应关系。无直接对应关系。野生型野生型（原始性状）（原始性状）特定环境特定环境突变型突变型（适应环境的新性状）（适应环境的新性状）驯化驯化定向定向诱变诱变筛选筛选？突变的原因突变的原因？变量实验（变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）Salvador LuriaMax DelbruckThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969变量实验（变量实验（fluctuation analysis）Newcombe的涂布实验（的涂布实验
27、（1949）影印实验（影印实验（replica plating）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）Joshua LederbergJ.Lederberg is awarded the Noble Prize in J.Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958Medicine and Physiology in 1958影印培养无药物无药物培养基培养基含药物含药物培养基培养基影印培养试验影印培养试验 原始敏原始敏感菌种感菌种2、自发突变的机制、
28、自发突变的机制主要的原因是：碱基主要的原因是：碱基互变异构体互变异构体的存在导致形成不同的存在导致形成不同 的碱基配对。的碱基配对。腺嘌呤氨基式腺嘌呤氨基式 AT配对配对腺嘌呤亚氨基式腺嘌呤亚氨基式 AC配对配对碱基置换碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生 转换转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。颠换颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。3、诱发突变的机制、诱发突变的机制 （1）碱基的置换（转换、颠换）碱基的置换（转换、颠换）（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误）
29、移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位A、碱基类似物碱基类似物5溴尿嘧啶溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）（胸腺嘧啶结构类似物）4、诱变剂、诱变剂B、嵌入诱变剂嵌入诱变剂C、与与DNA碱基直接其化学反应的诱变剂碱基直接其化学反应的诱变剂D、辐射和热辐射和热嘧啶嘧啶嘧啶二聚体嘧啶二聚体UV四、四、DNA损伤的修复损伤的修复1、光复活作用、光复活作用 (photoreactivation)嘧啶二聚体嘧啶二聚体嘧嘧 啶啶 光解酶光解酶2、切除修复切除修复(excision repair)3、重组修复（复制后修复、重
30、组修复（复制后修复 post replication repair）4、SOS修复修复 DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。的一种应急反应。错误倾向的错误倾向的SOS修复修复五、微生物诱变育种五、微生物诱变育种诱变育种：诱变育种：指利用各种指利用各种诱变剂处理微生物诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。（1）使用简便有效的诱变剂）使用简便有效的诱变剂（2）选用优良的出发菌株）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单
31、孢子悬浮液处理单细胞或单孢子悬浮液诱变剂诱变剂物理因素：紫外线、激光、离子束、物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、射线、射线等射线等化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物（4）使用最佳的处理剂量）使用最佳的处理剂量致死剂量：致死剂量：将微生物全部杀死的剂量将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：亚致死剂量：将将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到以上，存活不到1%，或者杀死，或者杀死90%以上，存活在以上，存活在10%以下。以下。弱致死剂量：弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死杀死一大半
32、，存活一小半，如杀死50-70%，存活，存活30%-50%，诱变处理一般选用亚致死剂量诱变处理一般选用亚致死剂量。处理剂量：处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应是指处理因素对微生物的生物学效应 剂量剂量=强度（浓度）强度（浓度）作用时间作用时间 相对剂量相对剂量=杀菌率杀菌率（5）设计高效率筛选方案）设计高效率筛选方案诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法突变株的筛选：产量突变株的筛选突变株的筛选：产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选抗药性
33、突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选(P152)第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组基因重组基因重组：指两种不同来源的遗传物质通过交：指两种不同来源的遗传物质通过交换和重新组合、形成新的基因型的的过程。通换和重新组合、形成新的基因型的的过程。通过基因重组所获得的后代具有特异的不同于亲过基因重组所获得的后代具有特异的不同于亲本的新基因组合。本的新基因组合。供体菌供体菌受体菌受体菌DNA片段片段1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象的
34、转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。转化：转化：指同源或异源的游离指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。转移过程。这些被转化的游离的这些被转化的游离的DNA片段称为片段称为转化因子转化因子。转转化后的受体菌，称为化后的受体菌，称为转化子（转化子（transformant）。（一）转化（一）转化（transformation)感受态细胞：感受态细胞：受体菌最容易接受外源受体菌最容易接受
35、外源DNA片段并实现转化的片段并实现转化的 生理状态称为感受态。生理状态称为感受态。进行转化，需要进行转化，需要二方面二方面必要的条件：必要的条件：1、建立了感受态的受体细胞、建立了感受态的受体细胞2、外源游离、外源游离DNA分子（转化因子）分子（转化因子）自然感受态自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制；自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNADNA 的能力，或人为地将的能力，或人为地将DNADNA导入细胞内导入细胞内转化因子通常是双链转化因子
36、通常是双链DNA。转化过程转化过程:感受态的出现感受态的出现 转化因子的吸附与掺入转化因子的吸附与掺入 转化因子的整合转化因子的整合 感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程分子的生命过程转染转染(transfection)：转染的特点：转染的特点：提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。人工转化：人工转化：用用CaCl2处理细胞，处理细胞，电穿孔电穿孔等是常用的人工转化手段。等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项
37、细菌基因重组手在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。电穿孔法电穿孔法（electroporation):用用高压脉冲电流高压脉冲电流击破细胞膜形击破细胞膜形成小孔，使各种大分子（包括成小孔，使各种大分子（包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，能通过这些小孔进入细胞，所以又称所以又称电转化电转化。（二）转导（二）
38、转导（transduction）转导：转导：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的一个细胞的DNA或或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。细菌转导的类型：细菌转导的类型：普遍普遍转导转导局限局限转导转导完全转导完全转导流产转导流产转导低频转导低频转导高频转导高频转导转导噬菌体：转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细带到另一个细菌的噬菌体。菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞片段的受
39、体细胞称为称为转导子转导子。在转导中被转移的染色体片段称为。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子转导因子。普遍转导（普遍转导（generalized transduction）噬菌体可以转导噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分供体菌染色体的任何部分到受体细胞中到受体细胞中普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。进入受体的外源进入受体的外源DNA通过通过与细胞染色体的重组交换与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子而形成稳定的转导子流产转导流产转导完全转导：完全转导：转导转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可不能进行整合、重组
40、和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其而其它细胞只能得到其基因产物。它细胞只能得到其基因产物。流产转导：流产转导：局限转导：局限转导：温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体割而连在噬菌体DNA上上缺陷噬菌体缺陷噬菌体把供体菌的少数特定基因把供体菌的少数特定基因转移到受体
41、菌中转移到受体菌中缺陷噬菌体缺陷噬菌体DNADNA分子在宿主细胞内能够象正常的分子在宿主细胞内能够象正常的DNADNA分子一样进行复制、包装，提供所需分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，感染受体细胞后，通过要的裂解功能，形成转导颗粒，感染受体细胞后，通过DNADNA整合进宿主染色体而形成稳定的整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。局限转导子。低频转导：低频转导：低频转导低频转导裂解物裂解物极少量的极少量的部分部分缺陷噬菌体缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）转导颗粒转导颗粒局限转导子局限转导子（极少量）（极少量）低感染复数低感染复数高频转导：高频转导：低频转
42、导低频转导裂解物裂解物正常噬菌体正常噬菌体极少量的极少量的部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）转导颗粒转导颗粒高感染复数高感染复数双重溶源菌双重溶源菌缺陷噬菌缺陷噬菌体和正常体和正常噬菌体同噬菌体同步复制步复制高频转导高频转导裂解物裂解物部分缺陷噬菌部分缺陷噬菌（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）正常噬菌体正常噬菌体等等量量转导转导颗粒颗粒局限转导子局限转导子（大量）（大量）局限转导与普遍转导的主要区别：局限转导与普遍转导的主要区别：a）局限转导中被转导的基因与噬菌体局限转导中被转导的基因与噬菌体DNA连接，与噬菌连接，与噬菌体体DNA一起进行复制、包装以及被导入受
43、体细胞中。一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。转导携带的宿主基因具有随机性。（三）接合（三）接合(conjugation)接合：接合：通过细胞与细胞的直接接通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组触而产生的遗传信息的转移和重组过程。结合后的受体菌称为过程。结合后的受体菌称为接合子接合子（c
44、onjugant）。）。1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。和重组所致。证实接合过程需要细胞间的直接接触的证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管型管实验（实验（Bernard Davis，1950）接合机制接合机制(大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。因子的质粒介导。F因子的分因子的分子量通常为子量通常为51
45、07，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的程进行的40多个基因。多个基因。F因子为附加体质粒因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上入（整合）到染色体上F F因子的四种细胞形式：因子的四种细胞形式：a）F-菌株菌株(“雌性雌性”菌株菌株)，不含不含F因因子，没有性菌毛，但可以通过接合子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收作用接收F因子而变成因子而变成F+菌株菌株；b）F+菌株菌株(“雄性雄性”菌株菌株)，F因子因子独立存在，细胞表面有性菌毛。独立存在，细胞表面有性菌毛。c）
46、Hfr菌株菌株，F因子插入到染色体因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。上，细胞表面有性菌毛。d）F菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的离的但携带一小段染色体基因的F因因子，特称为子，特称为F因因 子。子。细胞表面同样细胞表面同样有性菌毛。有性菌毛。“接合接合”“转化转化”及及“转导转导”这三种在自然界中存在的这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：细菌遗传重组过程各自的特点：外源外源DNA的来的来源及源及进入进入途径途径有差有差异异（四）原生质体融合（四）原生质体融合原生质体
47、融合：原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌（包括种间、将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）融合成为一个新的重组子的技术。种内、及属间）融合成为一个新的重组子的技术。原生质体融合步骤：原生质体融合步骤：1、原生质体制备、原生质体制备2、原生质体融合和再生、原生质体融合和再生3、融合子的选择、融合子的选择+二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交杂交杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染
48、色体重组，并：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。产生新遗传型后代的一种方式。（一）有性杂交（一）有性杂交（二）准性杂交（二）准性杂交准性生殖准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它可使是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。在半知菌类中最为常见。2、核配和杂合体细胞二倍体的形成、核配和杂合体细胞二倍体的形成1、菌丝联合形成异核体、菌丝联合形成异核体准性生殖的过程：准性
49、生殖的过程：杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在数分裂，但在有丝分裂有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。从而形成各种分离子。3、体细胞交换和单倍体化、体细胞交换和单倍体化体细胞交换：体细胞交换：有丝分裂过程中局部染色体片段交换的现象。有丝分裂过程中局部染色体片段交换的现象。单倍体化：单倍体化：指整条染色体在有丝分裂过程中由于染色体不分离而丢指整条染色体在有丝分裂过程中由于染色体不分离而丢 失的现象。失的现象。第四节第四节 微生物基因表达的调控微生物基因
50、表达的调控 一、操纵子（一、操纵子（operon)的转录调控的转录调控操纵子：操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功 能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因 (operator)和启动区（和启动区（promoter)的调控。的调控。promoteroperatorgene Agene Bgene C基因基因转录转录调控调控负转录调控负转录调控正转录调控正转录调控负控诱导负控诱导负控阻遏负控阻遏正控诱导正控诱导正控阻遏正控阻遏1、负转录调控（、负转录调控（negative tr
