1、1Neurotrophic Factors23n一个漫长却精彩的故事4n从前，人们不知道 在发育的过程中，一个神经元怎样找到它的靶组织5 直到，一个聪明的老头儿，做了一个聪明的实验 61934:Victor Hamburger discovered that removal of a limb bud resulted in reduced numbers of sensory and motor neurons in the spinal cord.7Based on his limb-bud experiments,V.Hamburger hypothesized that the tar
2、gets of innervating neurons provide signals that recruit undifferentiated cells to develop into sensory or motor neurons.(he was wrong)In 1942,Levi-Montalcini and Levi proposed that target derived signals maintain survival of differentiating neurons.In 1949,Hamburger and Levi-Montalcini repeated the
3、 limb bud experiments and found that their results supported the neurotrophic hypothesis.Hamburger,V.and Levi-Montalcini,R.(1949)J.Exp.Zool.111:457-502.8Effect of Removing or Augmenting Neural Targets on the Survival of Related NeuronsnPN23092.JPG 1949:Victor Hamburger showed that transplantation of
4、 a supernumerary limb resulted in increased numbers of sensory and motor neurons in the spinal cord.9神经元与靶组织的胜利会师！神经元与靶组织的胜利会师！10那么，为什么神经元需要如此强得依那么，为什么神经元需要如此强得依赖自己的靶组织？赖自己的靶组织？n要满足发育中神经系统与其服务的机体的比例n所需的神经元的数目要与其靶组织精确的匹配一个普遍的，令人惊叹的策略一个普遍的，令人惊叹的策略11如何实现？如何实现？n脊髓中的这些神经元，与其他的神经元竞争存在于其靶标（肢芽）的某种资源，而这种资源是有
5、限供应有限供应的。n因此，成体神经元的数目并非非最初被强硬的遗遗传决定传决定的，而是可以在发育的个体中被特殊的神经元-靶组织的相互作用而决定。12营养作用的分子基础营养作用的分子基础n关于神经元及其靶标的假说：q第一，最小剂量依赖。q第二，靶源组织分泌。q第三，数量有限。131415NGF的简史的简史n鸡胚移植实验n测定方法的建立n分离、纯化、命名n诺贝尔161954:neurite outgrowth assay extract+extract1969:NGF purified to homogeneityStanley CohenRita Levi-Montalcini1986:Levi-
6、Montalcini and Cohen split the Nobel prize for Physiology or Medicine“for their discovery of growth factors”1960:NGF purified17关于关于NGF遗留的问题遗留的问题q生理环境下对神经存活的重要作用 n通过慢性注射NGF的抗血清来剥夺发育中的老鼠的NGF（knockdown）导致成年小鼠失去大量NGF依赖的神经元n注射外源性NGF（overexpression）则可以引起膨大的交感神经节与NGF剥夺的现象正好相反。18n没有直接证据显示NGF是由其靶组织合成，或者说神经元从
7、靶组织摄取。n神经组织中受体的存在？n特别是，NGF的信号只在生长的神经元轴突接触到其靶标后才出现19NGF summayNGF可以介导两类特殊的神经细胞类群交感神经元和一些感觉神经节细胞）相关神经元在NGF剥夺的情况下会死亡；而更多的NGF则可以使更多的神经元存活；存在于神经元的靶组织；在相关的投射神经元中存在NGF的受体。神经营养因子的金标准神经营养因子的金标准20NGF:sympathetic neurons and some sensory neurons(CNS neurons do not require NGF for survival)BDNF:NGF-related fact
8、or purified in 1982 from pig brain(shares 50%homolog with NGF)NT-3 and NT-4/5:were obtained by PCR cloningAll these factors are synthesized as 250 aa precursors that are processed into 120 aa proteins21Neurotrophins BDNF(brain derived neurotrophic factor)on cortical neurons222324NTF的分类Neurotrophins(
9、NT)NTFCNTF(ciliary neurotrophic factor)GDNF(glial-cell-line-derived neurotrophic factor)NGF(nerve growth factor)BDNF(brain-derived neurotrophic factor)NT-3(neurotrophin-3)NT-4/5(neurotrophin-4/5)NT-6(neurotrophin-6)NT-7(neurotrophin-7)25n这些实验的结果显示出，NGF可以本地作用于刺激突起末梢的生长-但这一细胞的其他突起，没有接触到NGF的，则回缩。另外，生理学
10、实验显示，NGF及其他的神经营养素可以影响突触的活性及可塑性，这一点相对独立于他们的细胞存活的作用。因此，神经营养素的活性有很高的选择性，依赖于神经营养因子的类型、相应神经元分化的阶段，以及神经营养信号参与的细胞区域。26睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)n1980年，Adler等由E8鸡胚眼中分离到CNTF，分子量20kDa的酸性蛋白，由199aa组成，进化上比较保守，与LIF、IL-6等构成成血细胞因子(hematopoietic cytokine)超家族n分子以单体形式存在，无糖基化位点，二级结构富含-螺旋结构，为维持活性所必需nCNTF
11、缺少信号肽序列，在真核细胞中表达的CNTF不能分泌到胞外27胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)n1993年6月，美国Synergen生物技术公司的Lin等发现并克隆了一种新的NTF，由134个氨基酸残基组成，分子量为15kDanGDNF前体有19个AA的信号肽，成熟多肽链中有7个保守的半胱氨酸，活体形式为二聚体 其它GDNFs成员：NTN(neurturin)、PSP(persephin)、ART(artemin)28非神经营养因子肽类生长因子n成纤维细胞生长因子(fibroblast growth fa
12、ctor，FGF)：aFGF、bFGFn表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)n胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)：IGF-I，IGF-IIn白细胞介素(interleukin，IL)：IL-1，神经白细胞素(neuroleukin)29神经营养因子的受体及信号转导神经营养因子的受体及信号转导30313233Trk受体的分布 nTrkA分布在交感、感觉、运动神经元及基底前脑nTrkB分布在整个NS中，在肺、肌肉也有少量表达nTrkC主要在大脑皮质，海马，小脑表达；TrkC与NT-3在外周分布的不一致性3435Trk受
13、体的信号转导n PLC-IP3/DAGnIP3-Ca2+/CaM：可诱导LTP，促进神经突起的生长，调节中枢突触神经递质的受体分型nDAG/Ca2+-PKC：生长相关蛋白GAP-43(growth associated protein-43)是PKC的一个底物，它在成熟突触中是神经发育、神经连接再生和突触可塑性的一个决定因子36p75NTR structureNGF KD=10-9M(all neurotrophinscan bind p75NTR)Roux and Barker(2002)Prog Neurobiol 67:203-23337p75NTR的结构特点n胞外区：4个重复的富含半胱
14、氨酸的结构域，与配体结合有关 n胞内：无固定的配体诱导的酶激活域，含有6个螺旋结构死亡结构域(death domain，DD)383940Trk受体与p75受体的相互作用 Trk受体与p75受体共表达，p75受体增加配体与Trk的结合力，TrkA对p75NTR介导的信号通路具有抑制效应 p75NTR介导的凋亡作用只有在细胞内Trk的表达水平很低或不表达的情况时才会出现41NT的主要生物学效应发育期：n促进神经元的存活，生长和分化成熟n对神经递质的选择作用n诱导神经纤维定向生长n控制神经元存活数量42NT的主要生物学效应成年期：nNT及其受体的表达和分布都明显减少，效应神经元对NT的依赖也明显降
15、低n维持部分神经元的存活和正常功能n神经元可塑性 n神经损伤修复43NT的主要生物学效应非神经系统：NT与其它肽类生长因子一样，也是多功能生长因子，可影响免疫、造血、内分泌、和生殖等系统的功能44CNTF的主要生物效应n对中枢和周围运动神经元的营养作用n影响非神经组织4546GDNF的主要生物效应n对多巴胺能神经元的营养支持n促进运动神经元发育、修复损伤后运动神经元n对感觉神经元的营养支持47NTF的作用模式n逆行信号转导（靶源性的）：经典的NTF作用途径；靶细胞合成NTF，经轴突末端的受体介导，逆行轴突转运到胞体4849NTF的作用模式n顺行信号转导：许多靶神经元依赖于传入投射维持其存活，上
16、游神经元通过大分子物质的顺行轴突转运对靶神经元起神经营养作用50NTF的作用模式nNTF的局部作用（旁分泌方式）：靶组织与其支配的神经元共存于同一组织，来自靶合成的NTF作用于临近效应神经元 Target51NTF的作用模式n神经鞘合成NTF：发育期、神经损伤期合成增加，成熟期降低；可在局部分泌为未建立神经靶联系的轴突提供营养52NTF的作用模式n通过胶质细胞介导：胶质细胞本身就能释放NTF；在某些生长因子存在时可释放NT完成神经营养作用53NTF的作用模式n神经元合成NTF：通过顺行轴突、逆行轴突转运以及局部作用的方式发挥作用54NTF的作用模式n自分泌作用：神经元，既合成NTF也有相应受体
17、表达，并对自身的NTF有反应；不能介导神经元与靶之间的相互作用，但可维持神经元直到与靶之间建立突触联系55NTF的作用模式n非分泌方式的NTF：CNTF，aFGF，bFGF缺少信号肽序列，不能分泌到胞外，细胞损伤时才能释放，适应神经再生需要56神经营养因子与疾病神经营养因子与疾病57基因敲除动物模型58NTFs及其受体基因敲除小鼠的表型缺失基因表型TrkA致死性，生后一个月内死亡，感觉及交感神经元缺失TrkB致死性，生后即死亡，面神经核和脊髓运动神经元缺失，三叉神经节、背根节缺失TrkC致死性，生后一个月内死亡，本体感觉缺失，运动姿势异常P75NTR非致死性，可存活至成年，但感觉神经元的一个亚
18、群丢失，周围感觉和交感神经分布缺陷NGF非致死性的，但出生后体重增加停滞、长疮、出现自毁倾向，感觉和交感神经节细胞缺失BDNF致死性，感觉神经缺陷，颅神经节、外周神经节缺失，最严重的是前庭神经节细胞显著丧失，行为表现为旋转、共济失调和呈弓状姿势NT-3致死性，感觉和交感神经元缺失，脊髓传入纤维数目下降，与传递本体觉有关的感受器（肌梭和高尔基腱器）丧失NT-4/5正常，10个月内无明显的神经元和表型异常BDNF+NT-4/5致死性，与单纯BDNF缺陷相似CNTF成体后运动神经元萎缩，数量减少，肌力降低GDNF、GFR1或Ret表现出相同的表型，即肾发育不全和胃肠道神经支配缺失，出生后不久全部死亡
19、59神经营养因子的临床应用前景神经营养因子的选择活性及临床应用可能 疾病作用部位NGFBDNFNT-3NT-4/5CNTFGDNF外周神经病 感觉神经元交感神经元ALS运动神经元基底前脑胆碱能神经元皮质神经元海马神经元PD多巴胺能神经元HD纹状体神经元局部缺血皮质神经元急性脑脊髓损伤皮质脊髓神经元神经系统肿瘤神经胶质瘤成神经细胞瘤60神经营养因子的临床应用前景n帕金森病(Parkinson disease，PD)：主要病因：黑质纹状体通路中的多巴胺能神 经元的进行性退化造成 治疗：BDNF GDNF：对DA能神经元作用最强的NTF61神经营养因子的临床应用前景n肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)主
20、要原因：运动神经元的致死性病变。治疗：除NGF外的NT以及GDNF、CNTF、IGF 其中BDNF和IGF-1已开始临床试验62神经营养因子的临床应用前景n阿尔茨海默病(AD)主要原因：胆碱能神经元的病变。治疗：多种NTF，维持胆碱能神经元的存活，上调ChAT表达63神经营养因子的临床应用前景n外周感觉神经病 主要原因：外周感觉神经元的退化。治疗：NGF为主64神经营养因子的临床应用前景n神经营养素为蛋白质，难以通过血脑屏障，故不能直接通过全身给药治疗中枢神经系统疾病 脑内给药 利用蛋白修饰增加穿过血脑屏障的能力 利用基因工程手段增加NTF的功能，扩大应用范围 多种NTF联用 寻找调控NTF及
21、其受体表达或启动信号转导的小分子物质65遗留的问题n找到靶组织以前，神经元靠什么活着？找到靶组织以前，神经元靠什么活着？n在在CNS中还没有发现神经元存活数目与中还没有发现神经元存活数目与NT的的联系联系n敲除敲除NT 或者或者Trk受体，可以发现引起可预测受体，可以发现引起可预测的的PNS的缺陷，但对的缺陷，但对CNS的结构和功能的影的结构和功能的影响非常小。响非常小。66目前的研究目前的研究n介导的信号介导的信号n受体降解速率受体降解速率n激活另外通路激活另外通路n抑制了去磷酸化的过程抑制了去磷酸化的过程67分泌方式的调控分泌方式的调控68膜表面受体量的调控膜表面受体量的调控69受体内吞后
22、命运的调控受体内吞后命运的调控7071THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.284,NO.22,pp.1512615136,May 29,200972n如果 你 提纯出了一种蛋白证明了它具有神经营养因子的特点73你的选择你的选择A:发了吧赶紧，发一个发了吧赶紧，发一个4-5分的分的B:得到得到DNA序列，表达模式，发一个序列，表达模式，发一个7-8分的分的C:敲掉看看，做些功能，发个敲掉看看，做些功能，发个cellD:找到受体，再发个找到受体，再发个cellE:Boss 决定决定74知道蛋白序列，怎样找到DNA序列？n兼并引物，兼并引物，PCRn表达文库，用抗体钓表达文库，用抗体钓n基因组测序的数据基因组测序的数据怎样找到受体怎样找到受体n酵母双杂交n免疫共沉淀nGST-pull downnCO-IP 结合质谱n7576Concept of Neurotrophic Factor(NTF)神经营养因子是机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类多肽或蛋白质因子,它不仅在发育过程中调节神经元的存活,而且能阻止成年神经元损伤后的死亡,促进神经元的修复、轴突再生、调节突触可塑性和神经递质传递等神经系统功能。NTF-NTF-神奇的神经元营养品神奇的神经元营养品n路漫漫其修远兮 吾将上下而求索77谢谢各位的时间！谢谢各位的时间！
