1、临床微生物学检查的合理开展与应用临床微生物学检查的合理开展与应用贾红兵中日友好医院检验科内容提要 实验室管理模式转变 微生物学检测的临床指征 微生物学检测过程 微生物学检测结果的解读 细菌耐药管理学理论变革 定义：管理、监督和控制的行为、方式和实践。起源：18世纪后期、美国 理论变革：工业经济 服务经济实验室管理模式转变实验室管理模式转变质量过程优化激励制度利润质量监督员雇员专家不局限于专家奖励高收入、低成本威胁/奖励；破坏团队消费者传统理论新理论（Deming）临床试验管理结构的转变 实验室是患者服务的一个组成部分实验室管理模式转变实验室管理模式转变实验室经典管理结构以服务为导向的实验室管理
2、结构主管管理人员技术人员/抽血者顾客服务/抽血者主管内科医生/患者临床与实验室关系实验室管理模式转变实验室管理模式转变服务服务需求需求/引导引导指导指导/探讨探讨微生物学检查合理开展和应用微生物学检查合理开展和应用了解和熟悉微生物室内容提要 实验室管理模式转变 微生物学检测的临床指征 微生物学检测过程 微生物学检测结果的解读 细菌耐药微生物学检查的临床指征临床指证临床指证 临床症状疑似感染存在 辅助检查疑似感染存在 不明原因 内容提要 实验室管理模式转变 微生物学检测的临床指征 微生物学检测过程 微生物学检测结果的解读 细菌耐药生物安全 生物安全性 临床医务人员 实验室人员 直接相关的几点 操
3、作人员的自我保护 对标本的保护 带针头的注射器直接送检 标本泄漏的处理微生物学检测过程微生物学检测过程实验室检测 一般分为3个阶段:分析前标本采集、转运和储存 分析中样本检测 分析后结果报告微生物学检测过程微生物学检测过程分析前标本采集、转运和储存 实验效率最为关键 华盛顿大学和加利福尼亚旧金山医学院对实验室事故报告进行分类：2000年6月至2001年9月之间,129份事故报告中有92份(71%)发生于分析前阶段微生物学检测过程微生物学检测过程分析前分析前标本选择和收集基本原则 避免自身菌群的污染，确定有代表性感染过程的标本 选择正确的解剖部位，采用适当方法来采集标本。选择合适的部位采集用于厌
4、氧菌培养的标本。活检或针头抽吸物是最佳选择，一般不用拭子用于厌氧培养。注意室温保存标本 标本量要足够 标本容器的选择（提高阳性率、无漏、无潜在安全性）标本容器应标明必要的信息微生物学检测过程微生物学检测过程分析前分析前可接受标本可接受标本不可接受标本不可接受标本抽吸物（用注射器）未保护的支气管肺泡灌洗液胆汁子宫颈拭子血液气管内抽吸物骨髓鼻咽拭子支气管镜，被保护的刷前列腺液、精液后穹窿穿刺术痰（自然排出、导流）鼻窦抽吸物粪便或直肠标本外科手术标本，如拭子、组织咽拭子膀胱穿刺尿尿道分泌物子宫，子宫内膜抽吸物尿液（自然排出、导尿管）粪便（用于梭状芽孢杆菌属检测）阴道拭子微生物学检测过程微生物学检测过
5、程分析前分析前标本转运 所有标本必须立即送交实验室，最好2h内。细菌培养标本的储存应不超过24h。厌氧培养的标本在专用容器转运或床旁接种。15-30min内转运 高度怀疑标本有以下的微生物感染时，包括志贺菌（立即处理）、淋球菌、脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌（对低温敏感）实验室间标本转运要有正确的标记、包装。微生物学检测过程微生物学检测过程分析前分析前标本拒绝标准 无标签，不处理，与送检医生或护士联系。非损伤方法获得的标本 损伤方法获得的标本 送检延迟，不处理。没有提供标本所适宜条件，不处理。同一天内同一检测条件的重复标本（血除外），不处理。疑难、罕见病例的会诊，即使所提供的标本质量受到损害，也必
6、须进行处理。微生物学检测过程微生物学检测过程分析前分析前可疑微生物信息而放弃的标本微生物学检测过程微生物学检测过程分析前分析前标本类型标本类型替代方法或建议替代方法或建议新生儿的胃抽吸物不处理呕吐物不处理结肠造口术排出物不处理烧伤，伤口（拭子）送交组织或抽吸物褥疮（拭子）送交组织或抽吸物坏疽损伤（拭子）送交组织或抽吸物牙周损害（拭子）送交组织或抽吸物直肠周围脓肿（拭子）送交组织或抽吸物静脉曲张性溃疡（拭子）送交组织或抽吸物检测方法分类微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中按试验方法分 直接涂片镜检法 免疫学法 传统培养法按检测对象分免疫学法（表面抗原）免疫学法（抗体）免疫学法（毒素）传统
7、培养法按检测速度分 快速检测方法 传统培养方法（不包括病毒细胞培养）快速检测法微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测病原分类病原分类临床微生物室常用方法临床微生物室常用方法病毒学检测免疫荧光、ELISA、荧光定量PCR（血清）衣原体检测Giemsa/免疫荧光直接镜检（查包涵体）、血清免疫学检测（ELISA、金标法、微量免疫荧光）立克次体检测免疫荧光直接镜检、血清学反应（外斐反应、ELISA）螺旋体检测血清免疫学检测支原体检测血清免疫学检测真菌检测直接涂片镜检、G试验和GM试验细菌检测直接涂片镜检、PCT、免疫学检测（CSF隐球菌检测、毒素检测、内毒素检测）微生物学检测过
8、程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测NEGATIVEPOSITIVENEGATIVEPOSITIVENEGATIVEPOSITIVEPOSITIVENEGATIVE微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测包涵体：衣原体感染单核细胞沙眼衣原体在上皮细胞内繁殖，在绿色荧光的表层细胞内形成桔黄-桔红色荧光的、大小不等的圆形包涵体微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测Fantana镀银染色：梅毒螺旋体暗视野显微镜：苍白螺旋体 1000倍微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测墨子染色：新型隐球菌KOH湿片：菌丝微生物学检测
9、过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测革兰染色：真菌丝革兰染色：酵母菌和假菌丝微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测分枝杆菌微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测淋病奈瑟菌PCT、G试验、GM试验 PCT：降钙素原（细菌性感染）PCT结果必须结合患者临床情况分析 动态监测比单点绝对值更有价值 G试验：(1、3)-D 葡聚糖（IFI：念珠菌，曲霉，镰刀霉，毛孢子菌，卡氏肺孢子菌，支顶孢霉，酵母菌属）动态趋势：反应抗真菌疗效 GM试验：半乳甘露聚糖（IA：曲霉）结果患者临床情况进行分析 连续监测尤为重要微生物学检测过程微生物学检测过程分析
10、中分析中-快速检测快速检测 PCT-Q：半定量0.5 ng/ml 2 ng/ml 10 ng/ml快速30min PCT LIA：定量0.1500ng/ml约2h微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测 VIDAS KRYPTOR 0.025000ng/ml微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测G试验：免疫比浊法试验：免疫比浊法GM试验：双抗体夹心法试验：双抗体夹心法微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-快速检测快速检测微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法支原体微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法
11、烟曲霉黄曲霉微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法黑曲霉构巢曲霉微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法金黄色葡萄球菌微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法弧 菌微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法VITEK-2自动化细菌鉴定和药敏仪微生物学检测过程微生物学检测过程分析中分析中-培养法培养法K-B法微量肉汤稀释法琼脂稀释法E-test法内容提要 实验室管理模式转变 微生物学检测的临床指征 微生物学检测过程 微生物学检测结果的解读 细菌耐药血培养微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读 诊断重要性诊断重要性 阳性
12、结果：确定病原+优化抗菌药物治疗 预后重要性预后重要性 血培养分离到的病原菌：表明宿主原发感染部位的抵抗力下降或机体不能清除病原菌或根除感染灶。分离的病原菌种类，对预后有重要意义。血培养几个定义微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读 菌血症：菌血症：血流中出现细菌。注意：分离自血液的细菌可能是败血症的原因，也可能不是或是污染菌。贯穿性菌血症：贯穿性菌血症：用抗菌药物治疗后仍持续存在的菌血症。注释1：早发贯穿性菌血症通常是由于不适当或不充足的抗菌药物治疗导致；注释2：晚发贯穿性菌血症通常是由于病灶（如脓肿）没有彻底引流 败血症：败血症：由感染引起的全身炎症反应综合征。败血症事件：败血症事件
13、：不管是败血症、严重败血症或感染性休克，都必须进行血培养。注释：根据血培养有无得到细菌，来决定败血症、严重败血症或感染性休克。全身炎症反应综合征全身炎症反应综合征（SIRS）血培养时间微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读 实际临床操作：血培养应该立即进行（或短时间实际临床操作：血培养应该立即进行（或短时间内）内）实验数据表明：细菌进入血流时间是在间歇热发生前大约1h。通常每30-60min进行一次血培养。但Li等研究表明：血标本抽取后立即或间隔24h再进行培养是没有区别的 Thompson等观察到血培养的阳性率与病人发热波峰并不相关。血培养次数微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解
14、读 推荐：每次血流感染事件进行推荐：每次血流感染事件进行2-3次血培养。次血培养。注注1：血培养后2-5天不必重复进行。注注2：重症监护、移植或血管内置导管，或经验性治疗的患者，提倡使用监测性血培养作为早期败血症检测指标。注注3：大多数具有细菌血症或真菌血症患者进行随访，并不需要再次进行血培养来证明血流感染是否清除。（例外：感染性心内膜炎患者；具有金葡菌血症的非感染性心内膜炎患者，在48-96h血培养再次阳性，有力预测存在复杂性金葡菌血症）血培养次数血培养次数1次阳性率次阳性率2次阳性率次阳性率3次阳性率次阳性率1975年Washington 80例（20ml）80%88%99%1983年We
15、instein等 282例（15ml）91%99%(281/282)/2004年Cockerill 163例（20ml）不含感染心内膜炎患者65%80%96%研究表明：感染心内膜炎患者90%血培养血量、血量分布和采集微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读血量血量血量分布血量分布成人每次血培养（每次静脉穿刺）推荐20-30ml配对需氧和厌氧血培养瓶配对需氧和厌氧血培养瓶注：抽血量少于推荐量，优先接种到需氧瓶中婴幼儿抽血量不超过患者总血量1%24h内收集2-3瓶推荐需氧瓶注：厌氧培养仅限母亲有高风险因素的新生儿：分娩时延迟破膜、绒毛膜羊膜炎、慢性口或鼻窦炎、蜂窝组织炎等采集严格执行无菌操作（
16、含碘的消毒剂需要足够的时间消毒表面，碘酒需要30s），推荐采集静脉血推荐采集静脉血。血培养培养方法微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读 传统肉汤培养法 双相培养 裂解-离心：用于真菌和分枝杆菌培养血培养三级报告制度标本核收、信息录入血培养瓶标记上机、振荡培养血培养阳性血培养阴性细菌涂片电话联系主管医生转种3天培养后发中间报告：“72h培养阴性”7天培养后仍为阴性盲传培养为阴性，发最终报告：“血培养未生长”鉴定、药敏微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读必要时必要时血培养初级报告：革兰染色结果血培养二级报告：初步药敏纸片法结果微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读呼吸道标本检
17、测 标准报告单内容 痰标本质量的实验室评价 正常菌群的菌属、菌量（半定量）致病菌的种属、菌量及药敏 实验室建议“无致病菌生长”“普通培养未生长”微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读分级 100镜下1个视野中的细胞数和白细胞数 扁平上皮细胞白细胞AB10C微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读国外国外微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读Gekler分级（国外）100镜下1个视野中的细胞数和白细胞数 扁平上皮细胞白细胞 光学显微镜（光学显微镜（100）A 级级(标本质量好)微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读光学显微镜（光学显微镜（1000）微生物学检测结果的解读微生
18、物学检测结果的解读C级（级（标本不可接受）光学显微镜（光学显微镜（100）微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读尿细菌计数 取1ul尿量接种到培养基。判断标准：中段尿 105cfu/ml 导尿 103cfu/ml（3种以内）膀胱穿刺尿 任意数注：中段尿和导尿中若有3种以上细菌生长均报告标本污染。重新送检。微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读L型菌培养 不局限于尿液 高度怀疑泌尿系统的L型菌感染 普通培养+L型菌培养+普通肉汤增菌培养 明确为L型菌培养阳性者 药敏为非L型菌的药敏，作用于细胞壁的抗菌药物无效。微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读便标本培养“便培养”一般主要是
19、指沙门菌属和志贺菌属检测 便培养（？）结合临床病情，高度怀疑致病菌，有针对性进行培养微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读2010年7-10月的332例腹泻患者病原菌筛查微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读患者数 病原菌数 分离率%气单胞菌属弯曲杆菌属 类志贺邻单胞菌 沙门菌属 志贺菌属 弧菌属 耶尔森菌属7月30516.712020008月1743017.2324145119月1112119.0221790010月1710.10010000合计合计332332575717.217.26 66 66 6232314141 11 1患者数 病原菌数 分离率%气单胞菌属弯曲杆菌属 类
20、志贺邻单胞菌 沙门菌属 志贺菌属 弧菌属 耶尔森菌属成人2374619.4666141211儿童951111.60009200合计合计332332575717.217.26 66 66 6232314141 11 1缺失致病性大肠杆菌的资料缺失致病性大肠杆菌的资料便涂片查菌群 球杆比 革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌比 菌群紊乱 正常菌群 二重感染 艰难梭菌艰难梭菌 金黄色葡萄球菌？白色念珠菌微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读微生物学检测结果的解读依据552例腹泻患者的就诊类型、年龄或病区进行分类，最高产毒性艰难梭菌分离率分别是：住院患者为11.7%（24/206）、
21、60岁患者为12.5%（19/152），外科患者为25.0%（3/12）。初步表明，长期住院、初步表明，长期住院、高龄高龄、抗菌药物、抗菌药物应用是引起应用是引起CDI危险因素；门诊腹泻患者中产毒性艰难梭危险因素；门诊腹泻患者中产毒性艰难梭菌分离率为菌分离率为1.6%（4/251），证实存在一定比例的社区获），证实存在一定比例的社区获得性得性CDI。内容提要 实验室管理模式转变 微生物学检测的临床指证 微生物学检测过程 微生物学检测结果的解读 细菌耐药细菌耐药细菌耐药细菌耐药机制 一、产生抗菌药物灭活酶 二、抗菌药物作用靶位改变 三、细菌细胞膜通透性改变，抗菌药物不易进入 四、细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外 五、其他机制（生物膜等）小结 传统培养、特殊涂片法仍然是“金标准金标准”开展快速微生物学检测为大势所趋大势所趋 免疫学检测 分子生物学检测(Real-Time PCR)建立规范沟通模式和定期参与临床感染病例讨论势在必行势在必行 建立实验室药敏试验种类与医院在用药物种类相适应的协调模式协调模式谢 谢
